Optimization of sample preparation methods for the mechanical characterization of tissue architectures

Günümüzde hücrelerin davranışlarının genetik ve biyokimyasal mekanizmalar kadar mekanik sinyallerle de kontrol edildiği hakkında detaylı bilimsel kanıt bulunmaktadır ve malzeme analiz yöntemleri biyomedikal alanda hücre-hücre iletişiminin fiziksel yönlerini araştırmak için sıklıkla kullanılmaktadır. Atomik kuvvet mikroskopu (atomic force microscope, AFM) sıvıda ölçüm alabilen bir yüzey karakterizasyon cihazıdır ve son yıllarda proteinler, nükleik asitler, hücreler ve dokular gibi biyomalzemelerin mekanik analizinde önemli bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Ancak biyolojik malzemelerin doğal olarak heterojen olmaları ve örnek hazırlama yöntemlerinin çeşitliliği nedeniyle, literatürdeki çalışmalar ve araştırma grupları arasında AFM sonuçları büyük farklar göstermektedir. Bu durum ise yapılan çalışmalardan genel sonuçlar çıkarılmasını engellemektedir. Her ne kadar literatürde ölçüm frekansı, AFM uç morfolojisi ve fiksatif kullanım süresi gibi faktörlerin ölçüm kalitesine etkisi detaylandırılmış olsada, önceki bu çalışmalar genellikle bakteri ve ökaryot hücreleri hakkında yapılmış olup, dokuların ölçümü konusu ise incelenmemiş bulunmaktadır. Dolayısıyla, AFM analizi için kullanılan doku hazırlama yöntemlerinin karşılaştırması, literatürde eksik olan bir konudur. Bu çalışma dört fare dokusunun (kalp, karaciğer, dalak ve böbrek) üç sık kullanılan örnek hazırlama yönteminden (parafin blok, dondurarak kesme (cryosectioning) ve agaroz blok) sonraki mekanik özelliklerini araştırmaktadır. Parafin blok yönteminde kullanılan fiksatif kimyasalların, dokudaki hücrelerarası matris yapısını cross-link ederek elastik modül değerlerini kayda değer bir miktarda arttırdığı gözlemlenmiştir. Parafin blok yönteminin aksine, dondurarak kesme ve agaroz blok yöntemleri canlı dokuya daha yakın elastikiyet sonuçları vermekte, ancak AFM ucunun örneğe yapışması sebebiyle yüksek ölçüm uzaklıkları (~10 μm) veya yapışmayan AFM uçlarının kullanılmasını gerektirmektedir. Ayrıca, agaroz blok örneklerinde uzun süre saklanama imkanı bulunmadığı için hızlı ölçüm yapılmalıdır. Dondurarak kesme data kalitesi ve ölçüm kolaylığı açısından ideal bir yöntem olarak görülmektedir, ancak %4 PFA ile perfüzyon bu yöntemde bile doku elastikiyetini artırdığı için AFM için perfüze doku kullanımını tavsiye edilmemektedir.