SIK2 üzerindeki ERK'e bağlı olası fosforilasyon bölgelerinin incelenmesi

Laboratuarımızda daha once yapılan çalışmalar, bir serin/treonin kinaz olan SIK2'nin FGF'e bağlı MAPK yolağının negatif regüle eden bir geri-besleme mekanizmasında rol aldığını önermektedir. SIK2'nin FGF2 ile kısa süreli uyarımda Müller hücrelerindeki hızlı aktivite ve treonin fosforilasyon artışının ve in vitro olarak ERK'in SIK2'yi direk olarak fosforlamasının gösterilmiş olması nedeniyle, ERK'in SIK2'nin aktive edici kinazı olduğu düşünülmektedir. Bu çalışma, hipotezimizi destekleyerek, FRS2 ve SOS1'in de SIK2'nin FGF2 stimüle edilen Müller hücrelerinde etkileştiği sinyal kompleksinde bulunduğunu göstermiştir. İkinci aşamada SIK2 üzerindeki ERK'e bağlı potansiyel fosforilasyon bölgelerinin incelenmesi üzerine yoğunlaşılmıştır. Bu amaçla SIK2 üzerindeki olası ERK hedef amino asitleri biyoinformatik yaklaşımla belirlenmiş ve bu aday amino asitler T758 ve T863 in vitro mutagenez yöntemi ile alanine değiştirilmiştir. Deneylerde ERK tarafından gerçekleştirilen fosforilasyonu SIK2'nin otofosforilasyon aktivitesinden ayırabilmek için bu mutasyonları üretirken kinaz inaktif SIK2 kullanılmıştır. HEK 293T hücrelerinde ürettirilen KI-SIK2 ve KI-SIK2'nin mutant versiyonları immünopresipitasyon ile izole edilmiştir. İzole edilen SIK2 örnekleri aktif ERK2 ile birlikte in vitro kinaz deneylerinde kullanılmıştır. Mutant KI-SIK2'ler ile KI-SIK2'nin ERK fosforilasyon düzeyleri arasında önemli bir fark olmadığını göstermiş olan veriler T758 ve T863 amino asitlerinin ERK'in hedef noktaları olmadığına işaret etmekterdir. Olası atipik ERK motiflerinin tanımlanabilmesi amacıyla kütle spektrometirisi analizi de yapılmış, ancak SIK2'nin kapsama seviyesindeki düşüklükten dolayı sonuç alınamamıştır. Bu çalışmalara ek olarak SIK2-Gab1 ilişkisinin daha derinlemesine incelenmesi yolunda ilk adım olarak bu proteinlerin bakteriyel anlatım yapıları da üretilmiştir.