Identification and utilization of autologous anti-tumor antibodies for the diagnosis and prognosis of cancer

Akciğer kanseri dünya çapında en çok ölüme yol açan kanserdir. Mevcut teşhis yöntemleri kısıtlı güce sahiptir ve hasta ömrünü anlamlı olarak uzatamamaktadır. Küçük hücreli akciğer kanseri (KHAK); en agresif akciğer kanseri alt türü olarak bağışıklık yanıtına yol açmaktadır ve bu yanıtın ölçülebilir ajanlarından biri otolog anti-tümör antikorlarıdır. Bu otolog antikorlar tümör henüz mikroskobik aşamadayken dahi ortaya çıkmaktadır ve bu sayede diğer teşhis yöntemlerinin tümörü tespit edemeyeceği durumlarda dahi tümör varlığını erken aşamada teşhis etmeye yarayabilir. Çalışmamızda otolog anti-tümör antikorları keşfetmek için yeni bir yöntem geliştirmeyi, KHAK, Kolorektal, Mide ve Over kanserlere özgü otolog antikorları keşfetmeyi, KHAK teşhisi ve prognozunda yararlı olabilecek otolog anti-tümör antikorlarını belirlemeyi ve doğrulamayı ve otolog antikorların otoimmün hastalık için yararlılığını araştırmayı hedefledik. Çalışmamızda bilinmeyen otolog anti-tümör antikorları keşfetmek için PA taraması temelli bir yöntem geliştirdik ve optimize ettik. Kanser (KHAK, kolorektal, mide ve over) hastaları, Behçet hastalığı ve sağlıklı kontrollerden oluşturulan serum havuzları ile PA taraması gerçekleştirdik. PA taramasının SEREX gibi diğer otolog antikor teşhis yöntemlerine göre üstün yönleri vardır. Havuz taramalarından seçilmiş klonlardan oluşan arraylerin tek tek serumlar ile tekrar taranması ile hassasiyet ve özgüllük değerlendirmeleri gerçekleştirdik. Kolaborasyon ile oluşturulmuş görüntü işleme yazılımları tarama çalışmalarının sonuçlarının değerlendirilmesinde kullanılmıştır. Değerlendirmeler sonucu seçilen klonlar PA üreticisinden temin edilmiştir ve bu klonlar ile His ile işaretlenmiş protein üretimi ve saflaştırması gerçekleştirilmiştir. Saf proteinler ile 3 farklı KHAK ve 2 farklı kontrol grubu için sonuçların her defasında tekrar değerlendirildiği ELISA taramaları yapılmıştır. Bu taramalardaki amaç belirlenen otolog antikorların değerli birer biyobelirteç olduğundan emin olmakdır. ELISA sonuçlarımız Western blot yötemiyle doğrulanmıştır. MC, SVM ve PC yöntemleri eşik değer belirlemek, panel oluşturmak ve ROC eğrisi çizimi için uygulanmıştır. Teşhis gücünün kıyaslanması için AUC değerleri analiz edilmiştir. Kaplan-Meier, UCR ve MCR yöntemleri antikorlar varlığı ile yaşam süresi arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi için uygulanmıştır. Ayrıca protein ifadesi ve otolog antikor varlığı arasındaki ilişki IHC ve ELISA değerlerinin analizi ile araştırılmıştır. Otolog antikor tespiti için geliştirdiğimiz yöntem ayrıca kolaboratif bir destek olarak NBD'ye özgü biyobelirteçlerin bulunmasında uygulanmıştır. KHAK için 23 farklı otolog antikor biyobelirteç PA taramaları sonucunda anlamlı olarak seçilmiştir. Bu antikorların 8'i için 3 KHAK ve 2 sağlıklı grubu için tüm ELISA taramaları tamamlanmıştır. Bunların altısından oluşturulacak bir panelin değerli olacağı MC ve SVM ile gösterilmiştir. Bu 6 antikorun dördünden oluşturulan panelin; SOX2, p53, POLB ve C11orf20, AUC değeri tüm 6 antikor ile oluşturulan AUC değerinden çok farklı değildir ve yüksek hassasiyet ve özgüllük elde edilebilmektedir (55% hassasiyet, 90% özgüllük). PC yöntemi ile yalnızca SOX2 ve p53 içeren panel ile oluşturulan AUC değeri diğer tüm AUC değerlerinden daha yüksektir (82% hassasiyet, 90% özgüllük). Tek başına değerlendirildiğinde genel yaşam süresi ile istatistiksel olarak anlamlı şekilde ilişkili bulunmasına rağmen hiçbir antikor varlığı tüm gruplar için genel yaşam süresi ile ilişkili bulunmamıştır. Çalışmamızda SOX2 protein ifade yoğunluğu ile otolog antikor varlığı arasında istatistiksel anlamlı ilişki bulduk. Mtch1'in NBD'ye özgü bir otolog antikor olarak keşfi ve doğrulanması ile yöntemimizin otoimmün hastalıklarda da yararlılığı anlaşılmıştır. Belirlediğimiz 4 otolog antikor ile oluşturduğumuz panel; SOX2, p53, POLB ve C11orf20, KHAK teşhisi için 55% hassasiyette 90% özgüllüğe sahiptir. Bu otolog antikorların ikisinin ilk defa bu çalışma ile SCLC teşhisinde kullanılabilirliği gösterilmiştir; POLB ve C11orf20. Dört antikorluk panel akciğer kanseri için piyasada mevcut tek otolog antikor temelli kit olan EarlyCDT-Lung'dan daha yüksek teşhis gücüne sahiptir. PC yöntemi ile 90% özgüllük için 82% hassasiyet değerine ulaşılabilmektedir. Bu teşhis gücü düşük doz bilgisayatlı tomografinin teşhis gücüne eşdeğerdir. Gelecek planı olarak PC yöntemini şimdiye kadar oluşturduğumuz tüm PA sonuçlarına uygulamayı ve bu yöntem temelli çalışan bir KHAK teşhis kiti geliştirmeyi hedefliyoruz.