9
Arşivlenen Tez
0
DOI Atanmış
0%
DOI Oranı
Anabilim Dalı
Aflatoksin B1 kaynaklı hepatosellüler karsinomalarda aday moleküler hedeflerin analizi
Hepatosellüler karsinoma (H.K.) dünyada en sık görülen kanserler arasında 6. sırada, kanserden ölüm nedenleri arasında da 3. sırada yer almaktadır. Hastalığın tanı ve tedavisinde yeni gelişmeler olsa da, sıklığı ve kötü prognozu nedeniyle H.K. hala önemli bir sağlık problemi olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu nedenle, moleküler patogenezinin bilinmesi, tanı ve tedavide kullanılabilecek yöntemlerin geliştirilmesi açısından çok önemlidir. Temel etiyolojik ajanlar olan hepatit B, hepatit C, aflatoksin B1 (AFB1) ve siroz tüm H.K. vakalarının yaklaşık %80?inden sorumludur. Aflatoksinler insan gıdalarında, tahıllarda, yemlerde ve her türlü kuru yiyeceklerde saklama koşullarında rutubetin artmasına ve sıcaklığa bağlı olarak, mantar türleri tarafından üretilen mikotoksinlerdir. Aflatoksinler arasında en bilinen ve genotoksik özelliği nedeniyle mutasyonlara yol açarak kanser gelişiminine neden olan AFB1?dir. AFB1?e maruz kalmış H.K. vakalarında p53 R249S (G>T) mutasyonu olduğu bilinmektedir. Ancak AFB1 kaynaklı H.K. gelişiminde, bu mutasyondan başka p53 yolağına eşlik eden diğer yolaklar ya da genlerin mekanizmaları henüz açığa çıkarılamamıştır. Çalışmamızda, p53 R249S (G>T) mutasyonundan önce ya da sonra oluşmuş olası genetik değişikliklerin tanımlanabilmesi amacıyla R249S mutasyonu taşıdığı bilinen MAHLAVU ve PLC/PRF hücre hatları kullanılmıştır. Karsinogenezde rol oynadığı ve diğer kanser türlerinde mutasyonu bildirilen 115 kanser geni yeni nesil dizi analizi yöntemi ile incelenmiştir. Ayrıca, son zamanlarda yüksek çıktılı genom araştırmalarında, AFB1 dışı faktörlerle oluşan H.K.?larda mutasyonu gösterilen BCORL1 ve ARID2 genleri de Sanger dizi analizi ile taranmıştır. İki hücre hattından elde edilen sonuçlar karşılaştırıldığında, toplam 117 gende AFB1 ile ilişkilendirilebilecek bir genetik değişiklik saptanmamıştır.
Farklı illerden toplanan su örneklerinde nıs inhibitörü olan perklorik asit düzeylerinin araştırılması
Perklorik asit suda oldukça mobil ve stabil bir inorganik anyondur. Perklorik asidin kimyasal özellikleri iyoda benzerdir ve sodyum-iyot taşıyıcısının (NIS) tiroid bezine iyot taşımasını baskılar. Yetersiz iyot alımı durumunda, hassas popülasyonlarda (gebeler, bebekler, çocuklar) tiroid disfonksiyonlarına neden olabilmektedir. Daha önceki çalışmada, İstanbul, Kayseri ve Isparta'da 24-saatlik idrar örnekleri analiz edilmiş ve çalışmaya katılanların perklorik aside maruz kaldığı görülmüştür. Bu çalışmada, Ankara, Isparta, İstanbul, Kayseri ve Sakarya şehirlerinden, tüm şehirleri kapsayacak şekilde toplam 145 rastgele örnek alınarak, musluk sularında perklorik asit düzeylerini belirlemek amaçlanmıştır. Perklorik asit analizleri için HPLC-MS/MS yöntemi kullanılmıştır. Deteksiyon limiti ve kantifikasyon limiti, sırasıyla, 0.008 ve 0.026 µg/L olarak hesaplanmıştır. Analizler arası varyasyon (%CV) düşük ve orta seviyedeki örnekler için hesaplanmıştır. Buna göre 0.4 ve 2 µg/L konsantrasyonundaki kontrol örnekleri için %CV değerleri, sırasıyla, %6.72 ve %2.72 olarak hesaplanmıştır. Örneklerin %97.9'unda perklorik aside rastlanmıştır. Ölçülen perklorik asit düzeyleri <0.02 µg/L ile 3.75 µg/L arasında değişmektedir. Örneklerin ortalaması 0.17 µg/L'dir. İstanbul, Ankara, Sakarya, Kayseri ve Isparta illerindeki medyan düzeyleri, sırasıyla, 0.081, 0.081, 0.041, 0.27 ve 0.029 µg/L olarak bulunmuştur. En yüksek perklorik asit konsantrasyonu 3.75 µg/L olarak Ankara'da ölçülmüştür. Kayseri ilinde medyan 0.27 µg/L, %75 persentil 0.34 µg/L olarak ölçülmüştür. Örneklerdeki perklorik asit konsantrasyonları, EPA tarafından musluk suları için belirlenen güvenlik sınırının (15 µg/L) altında saptanmıştır. Sonuç olarak, bu şehirlerde insanların maruz kaldığı perklorik asit kaynağının sular olmadığı gözlenmiştir. Asıl kaynağın besin maddeleri olduğu düşünülmekte ve bundan sonra yapılacak araştırmaların bu yönde devam etmesi gerekmektedir.
Meningiom ve glioma olgularında D vitamini düzeylerinin araştırılması
D vitamini kalsiyum metabolizmasında ve kemik gelişiminde görevli olan bir hormondur. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda D vitamininin proliferasyon, farklılaşma ve hayatta kalma gibi farklı birçok hücre fonksiyonunda rol oynadığı bulunmuştur. Bunun sonucunda, birçok kanser tipinde anti-kanser ajanı olarak çalıştığı düşünülmektedir. Bu nedenle sunulan çalışmada, santral sinir sisteminin en sık görülen tümörleri olan ve yaklaşık %70'lik bir bölümünü oluşturan meningiom ve glioma ile serumda sirküle eden 25(OH)D3 miktarlarının ilişkisi incelenmiştir. Çalışmada, 83 meningiom, 105 glioma ve 193 kontrol bireyinden alınan serum örneklerinde LC-MS/MS (sıvı kromatografisi sıralı kütle spektrometresi) yöntemiyle 25(OH)D3 miktarları belirlenmiştir. Meningiom, glioma ve kontrol grubu örneklerinin D vitamini konsantrasyonlarının ortalama-medyan değerleri sırasıyla 13-11 ng/ml, 15-12 ng/ml ve 18-15 ng/ml olarak bulunmuştur. Tümör tipi, derecesi ve cinsiyete göre oluşturulan 26 alt gruba tek yönlü, non-parametrik ANOVA testi olan Kruskal-Wallis testi uygulanmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, hem hasta hem de kontrol popülasyonunda orta düzeyde D vitamini eksikliği saptanmıştır. Tüm çalışma kohortunda erkeklerde kadınlara göre çok daha yüksek oranda 25(OH)D3 saptanmıştır. Bu durum, her iki hasta popülasyonu için cinsiyet faktörünü ortadan kaldırmak için farklı kontrol grupları kullanılması gerektiğini göstermiştir. Araştırmada meningiom, meningiom kontrol, glioma ve glioma kontrol serum örneklerinde 25(OH)D3 konsantrasyonları sırasıyla 11, 15, 12 ve 17 ng/ml olarak bulunmuştur. Buna göre, meningiom grubu, kontrol grubuna göre %26, glioma ise %30 daha az bulunmuştur. Bu farklılık istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0.05). Meningiom ve glioma grupları arasındaki farkın ise anlamlı olmadığı saptanmıştır. Sonuç olarak, yapılan çalışmalarda D vitamininin etki ettiği yolaklarda rol alan birçok molekülün aynı zamanda meningiom ve glioma oluşumuna da etki ettiği ve bu çalışmada tümör gruplarında kontrol gruplarına kıyasla daha düşük seviyelerde 25(OH)D3 bulunduğu göz önüne alınırsa, daha büyük kohortlarla validasyonu sağlandığı takdirde, bu hasta gruplarında D vitamini yönünden koruyucu önlem alınması yoluna gidilebilir.
İnsan ve keçi kolostrum whey fraksiyonu ortak proteinlerinin maldı-TOF/TOF yöntemi ile belirlenmesi
Anne sütü, yenidoğanlar için en önemli besin kaynağı olmanın yanında sindirilebilir aminoasit kaynağı, immunolojik koruma ve gelişimsel fonksiyonların desteklenmesini sağlamaktadır. Anne sütünün yenidoğanın gelişmesindeki rolü, sütün farklı fraksiyonlarında bulunan whey proteinleri ve kazeinlerden oluşan skim milk proteinleri ve MFGM proteinleri (milk fat globule membrane) tarafından sağlanmaktadır. İnsan sütünün farklı türlerin sütünden en büyük farklılığı, whey fraksiyonunun majör protein kaynağı olmasıdır. Bu nedenle, whey proteinlerinin belirlenebilmesi için yapılan çalışmalar, süt biyogenezinin anlaşılması ve süt protein fonksiyonlarının belirlenebilmesi için önem arz etmektedir. Çalışmada proteomik yöntemler kullanarak insan ve keçi kolostrumunun skim fraksiyonundaki ortak whey proteinlerini belirlemek ve kıyaslamak amaçlanmış; insan sütünün yerine kullanılabilecek alternatiflerin protein içeriklerinin belirlenmesine katkı sağlamak hedeflenmiştir. Bu amaçla, laktasyonun başlangıcındaki (12-24 saat) sağlıklı insan (n=6) ve keçi (n=6) kolostrum örnekleri toplanarak, 2-DIGE (two dimensional differential gel electrophoresis) jel görüntülerindeki insan ve keçi kolostrumuna ait çakışan spotlar kesilip tripsin ile digest edilip MALDI-TOF/TOF (matrix assisted laser desorption ionization) kütle spektrometrisi yöntemiyle tanımlama yapılmıştır. Kütle spektrometri analizi sonuçlarına göre, insan ve keçi kolostrumunun whey proteinlerini içeren örneğinin bulunduğu master jelde çakışan 422 spot bulunmuştur. Bu spotlarda hem insan hem de keçi örnekleri için 270 adet farklı protein saptanmıştır. Bu proteinlerden; immünoglobulin, kazein, albümin, laktoferrin, laktotransferrin, laktoglobulin ve laktalbumin kökenli proteinler spotlarda en fazla görünen (HAP) majör proteinlerdir. Ayrıca α1-antitripsin, integrin, kathelisidin, galaktin-3-binding protein, laktadherin, tenascin ve apoliprotein J gibi minör proteinlerde (LAP) tespit edilmiştir. Çalışmada elde edilen sonuçlar, keçi ile insan kolostrumunda bulunan ortak proteinlerin profillerinin belirlenmesi için öncü nitelik taşımasına rağmen; özellikle insan sütüne alternatif formüllerin geliştirilmesi göz önüne alındığında, insan ve keçi kolostrumuna ait proteomik profillerinin detaylıca incelenmesi ve ortak olmayan proteinlerin profil farklılıklarının belirlenmesi gerekmektedir.
Gliomaların oluşmasındaki genetik faktörlerin incelenmesi
Beyin dokusundan kaynaklanan en sık görülen kanser tipi "gliomalardır". Son 5 yıl içinde yapılan çalışmalar, glial tümörlerin gelişiminde "izositrat dehidrogenaz" (IDH) enzim mutasyonlarının kanserleşmenin erken safhalarında rol oynadığını göstermiştir. Bu tezin konusu olan araştırmanın amacı, bu SNP'lerin gliomalar ile ilişkisini ilk defa Türkiye kaynaklı bir hasta popülasyonunda analiz etmek ve diğer onkogenik değişimler ile olası ilişkisini ortaya çıkarmaktır. Bu yüzden, glioma hastalarından elde edilen periferik kan ve tümör örnekleri ile kontrol popülasyonunda periferik kandan elde edilen DNA'larda rs4295627 genotiplemesi yapılmıştır. Daha sonra, risk alelinin gliomalarda sık görülen onkogenik bozukluklarla ve yine 8q24.21 yerleşimli SNP rs55705857 ile ilişkisi analiz edilmiştir. Çalışmada glioma histopatolojik tanısı ile opere edilen 135 hasta ve 164 sağlıklı kontrole ait örnekler kullanılmıştır. Bu 135 tümör dokusu kanserleşmenin farklı evrelerindeki (grade-II, grade-III, grade-IV) ve farklı alt tipteki (oligodendroglioma, astrositom, oligoastrositom, glioblastoma multiform ve gliomatoz serebri) glioma örneklerinden seçilmiştir. Analize tabi tuttuğumuz Türkiye kaynaklı hasta popülasyonunda elde ettiğimiz sonuçlar, 8q24.21 yerleşimli rs4295627 numaralı SNP ile gliom yatkınlığı arasında güçlü bir ilişki olduğunu ortaya koymuştur. Bu ilişki özellikle grade-2 ve grade-3 tümörlerde ve oligodendrogliomalarda daha güçlü biçimde gözlenmiştir; IDH mutasyonu taşıyan gliomalarda ise daha zayıf bir ilişki görülmüştür. Diğer taraftan, rs4295627 genotipi ile tümör örneklerinde belirlenmiş olan yaygın onkogenik bozukluklar (1p19q kaybı, p53 ifadesi, p16 ifade kaybı, PTEN ifade kaybı, hTERT promotor mutasyonları, hTERT-C228T mutasyonu) ya da rs4295627'in yatkınlık etkisinden sorumlu olduğu iddia edilen rs55705857 numaralı SNP ile istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki gözlenmemiştir. Son olarak, rs4295627'nin etkisinin artan tümör derecesi (grade) ile ters korelasyon gösterdiği görülmüştür.
Postmenopozal kadınlarda GC RS2282679'un vitamin D seviyelerinin osteoporozla ilişkisi
D vitamini bağırsaklardan ve böbreklerden kalsiyumun emilmesini sağlayarak iskeletin normal gelişimi için çok önemlidir. D vitamini eksikliği osteoporoz için önemli risk faktörüdür. D vitamini, dolaşımda D vitamini bağlayıcı protein ( VDBP) ile taşınır. D vitamini bağlayıcı protein Gc geni tarafından kodlanır. Gc geni insanlarda 4. kromozomda 4q11-q13 bandında lokalizedir. Bu çalışma postmenopozal kadınlarda D Vitamini Bağlayıcı proteinini kodlayan GC geninde, vitamin D seviyelerini etkilemesi muhtemel bir varyant olan 12. intronda bulunan Gc rs2282679' un vitamin D seviyeleri ve kemik mineral yoğunluğu ile ilişkisini araştırmayı hedeflemektedir. Çalışma için sağlıklı 100 menapoz sonrası kadında sigara ve alkol gibi risk faktörleri ve demografik bilgileri sorgulandı. Periferik venden alınan kanın bir kısmı vitamin D ölçümleri için serumu ayrıştırıldı, diğer kısmından polimorfizm analizi için DNA'sı izole edildi. Vitamin D seviyesi ölçümleri LC-MS-MS metodu ile çalışıldı. DNA izolasyonu sonrası intron 12 bölgesi nested PZR ile çoğaltılarak restriksiyon uzunluk polimorfizmi ile polimorfik bölge tayin edildi. Kemik yoğunluğu ölçümleri için omurga ve femur bölgeleri T skorları kullanıldı. Çalışma grubunda Vitamin D ortanca değeri 9(13) ng/dl olarak normal değerlerin çok altındadır (35-50 ng/dl), Genotip frekansları AA, AC ve CC için sırasıyla 0.14, 1.67 ve 0.19 bulunmuştur. Vitamin D değerleri yabanıl tip ve polimorfik homozigotlarda istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermiştir (p=0.025).Yine yabanıl homozigotlarda vitamin D değerleri polimoerfik genotipler kıyaslandığında (AA vs AC+CC) anlamlı derecede yüksektir (0.042). Sonuç olarak literatüre uygun olarak Vitamin D seviyeleri yabanıl tip genotipe sahip kişilerde polimorfik tipe kıyasla daha yüksektir. Kemik yoğunluğu ölçümleri yabanıl ve polimorfik tiplerde istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır.Sonuçlar daha geniş kohortlarda tekrarlanmalıdır.
DNA polimeraz γ proteinine bağlanan yeni moleküllerin belirlenmesi ve kanser hücresi üzerine etkilerinin araştırılması
Kanser tedavisinin başarılı olması normal hücrelere zarar vermeden seçici olarak tümör hücresinin öldürülmesine bağlıdır. Bu seçici sitotoksisite, DNA tamirine bağlı sentetik letal etkileşimler üzerinden gerçekleşebilir. MLH1 ve DNA polimeraz γ (Pol γ) arasındaki sentetik letal ilişki, MLH1 mutasyonunun dolayısıyla yanlış eşleşme tamir hasarının neden olduğu polipsiz kolorektal kanser hücrelerinin, normal hücrelere zarar vermeden tedavi edilmesini, Pol γ'nın inhibisyonu ile mümkün kılar. Bu çalışmada, MLH1 proteini bulunmayan kanser hücrelerine seçici sitotoksisite gösteren küçük molekülleri tespit etmek için, Pol γ proteinine doğrudan bağlandığını belirlediğimiz Prestwick kimyasal kütüphanesi® moleküllerinin MLH1 proteini bulunmayan (HCT116-VA) ve MLH1-proteini bulunan (HCT116-V1) kanser hücreleri üzerine etkisi araştırılmıştır. Kütüphanede bulunan 1200 molekülden 7 molekülün Pol γ'ya doğrudan bağlandığı yüzey plazmon rezonans analizi ile tespit edilmiştir. Bu moleküllerden Prestw-272'nin MLH1 proteini bulunmayan HCT116 hücresine (IC50: 5,72 µM) MLH1-proteini bulunan HCT116-V1 (IC50: 36x103 µM ) hücresine kıyasla daha letal olduğu gerçek zamanlı hücre analizi ile tespit edilmiştir. Prestw-272 molekülünün Pol γ'nın sessizleştirildiği HCT116-VA hücresinin canlılığını etkilememesi ama Pol γ'nın bulunduğu kontrol shRNA-HCT116-VA hücresinin proliferasyonunu etkilemesi, bu inhibitörün etkisinin Pol 'nın hücresel fonksiyonu üzerinden olduğunu göstermiştir. Bu veriler, MLH1 mutasyonu nedeniyle oluşan kanserlerin seçici tedavisi için Prestw-272'nin, potansiyel yeni bir molekül olarak geliştirilebileceğini göstermektedir.
Biotinidaz eksikliği olgularında genetik değişikliklerin araştırılması
Biotin vücutta bulunan karboksilaz enzimlerinden dördünün kofaktörü olarak görev alan, suda eriyen vitamindir. Öncelikle biotin, enzimin yapısındaki apoproteinlere kovalent olarak bağlanarak bu enzimleri aktif hale getirir. Bu bağlanma holokarboksilaz sentaz tarafından gerçekleştirilir. Biotinidaz eksikliği, biotin eksikliği sonucunda oluşan, nörolojik ve cilt anormallikleri ile karakterize olan otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. Eğer tedavi edilmezse, hücre içi biotinin tükenmesi biotin bağımlı karboksilaz aktivitesinin bozulmasına yol açar ve bozukluğun olduğu bireylerde nörolojik anormalliklere neden olabilir. BTD geni biotinidaz üretimi için, sorumlu enzimi kodlar. BTD geni 3p25 lokusunda yer alan dört ekzonlu 543 aminoasit kodlayan bir gendir. Biotin eksikliği ile alakalı olan BTD geninde 402'nin üstünde mutasyon saptanmıştır. Mutasyonlar, BTD geninde biotinidaz enzim aktivitesini değiştirir. Bu çalışmada, Acıbadem Labmed Klinik Laboratuvarında Temmuz 2013-Şubat 2014 tarihleri arasında yenidoğan metabolik tarama sonuçlarında biotinidaz enzim eksikliği tanısı konan toplam 43 hastanın, tarama sırasında kullanılan Guthrie kağıtlarından DNA izolasyonu yapılarak, BTD genine ait daha önceden literatürde rapor edilmiş olan en sık rastlanılan c. 98_104del7insTCC, A171T (c. 511G>A), D444H (c.1330G>C), Q456H (c. 1368A>C), R538C (c. 1612C>T) mutasyonları için DNA dizi analizi yöntemi kullanılarak mutasyon taraması yapılmıştır. Dizi analizi sonucu saptanan mutasyonlar sınıflandırıldığında, daha önceden literatürde rapor edilmiş, c. 98_104del7insTCC, D444H (c.1330G>C), Q456H (c. 1368A>C) mutasyonları doğrulanmıştır. A171T (c. 511G>A) ve R538C (c. 1612C>T) mutasyonlarına ise rastlanılmamıştır. Bulunan mutasyonlar için biotinidaz enzim eksikliğinin serum düzeyinde kontrolü sağlanılarak, gerekli doğrulama yapılmıştır. Çalışmamız ülkemizde biotinidaz eksikliğinin genetik tanısı için BTD geninin tümünün analizinin gerekliliğini ortaya koymuştur.
Sporadik alzheimer hastalığında DNA hedef gen varyantlarının taranması
Demansın en sık görülen türü olan, Alzheimer hastalığı (AH) çok etkenli sebeplerle ortaya çıkan kompleks nörodejeneratif bir hastalıktır. Erken teşhisin sporadik AH'nın ilerlemesini yavaşlattığının ve semptomlarını azalttığının saptanmasıyla sporadik AH için genetik risk faktörü tarama çalışmaları hız kazanmıştır. Sporadik Alzheimer hastalarının post-mortem beyin dokularında, Alzheimer fare modellerinde ve hücre hatlarında, spesifik bir baz eksizyon DNA tamir (BER) geni olmayan fare modelleri ve hücre hatlarında yapılan biyokimyasal, moleküler, hücresel ve davranış çalışmaları sporadik AH'nin etiyolojisi ve patolojisi ile BER mekanimasında meydana gelen hasarlar arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmıştır. BER yolağında görev alan proteinlerden biri olan POL β'nın ifade, miktar ve aktivitesinin sporadik AH'da çok düşük düzeyde olduğu ve total BER kapasitesinin POL β'ya bağlı olarak düştüğü gösterilmiştir. Bu nedenle, bu çalışmada, sporadik Alzheimer hastalarının post-mortem beyin dokularında POL β geni lokusu hedefe yönelik yeni nesil sekanslama yöntemiyle taranmıştır. POL β geninin 12. ekzonunda yerleşik rs3136797 (pro242arg) polimorfizmi ve 63 adet intronik polimorfizm saptanmıştır. Yaptığımız çalışmada elde ettiğimiz genetik değişimler arasında sadece Alzheimer hastalarında görülen polimorfizmlerden bazıları ilk kez bu çalışmada tespit edilmiştir ve toplumdaki sıklığı bilinmemektedir. AH dışındaki hastalıklar ile ilişkilendirilmiş ve maf değeri %1'in altında olan bazı polimorfizmler Alzheimer hastalarında ilk kez bu çalışmada gösterilmiştir. Alzheimer hasta grubunun çoğunluğunda belirgin bir şekilde öne çıkan bir polimorfizm olmasa da aynı kişide birden fazla POL β geni polimorfizmi saptanmış olup, bu ek (additive) bir etki yaratabilir. Bu çalışmada saptanan polimorfizmlerin, sporadik AH tanısında bir biyobelirteç olup olamayacağını göstermek için, popülasyon çalışmaları ile örnek sayısı artırılıp, önemli olabileceği düşünülen genetik varyantların toplumdaki sıklığı araştırılarak, sporadik Alzheimer hastalarındaki sıklığı ile karşılaştırılmalıdır. Yeni bulunan genetik değişimlerin hastalığın etiyopatolojisindeki rolleri işlevsel olarak araştırılmalıdır.