In silico and in vitro analysis of CLOCK gene SNPs from 1000 genome project

Sirkadiyen ritim, organizmalarda ~24 saatlik fizyolojik ve davranışsal süreçleri düzenleyen içsel bir süreçtir. Memelilerde sirkadiyen ritim, çekirdek saat proteinleri arasındaki etkileşimin bir sonucu olarak transkripsiyon ve translasyonel geri besleme döngüsü (TTFL) mekanizması tarafından üretilir. TTFL'de, CLOCK ve BMAL1 birbirleriyle etkileşime girer ve Period (Per) ve Cryptochrome (Cry) dahil olmak üzere saat kontrollü genlerin transkripsiyonunu başlatmak için promotör bölgesindeki E-box dizilerini bağlamak için bir heterodimer oluşturur. Zaman içinde, CRY'ler ve PER'ler sitozolde birikir ve daha sonra Casein kinase Iε ile çekirdeğe girer ve BMAL1: CLOCK temelli transkripsiyonu baskılar. Sirkadiyen ritmi kontrol eden başka yardımcı TTFL'ler de vardır. Genetik ve epidemiyolojik çalışmalar, sirkadiyen ritmini bozan faktörlerin obezite, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, yaşlanma, kanser, duygudurum ve uyku bozuklukları gibi çeşitli hastalıklara doğrudan neden olabileceğini düşündürmektedir. Çekirdek saat genleri için birkaç tek nükleotid polimorfizmi (SNP) tanımlanmış ve farklı hastalık türleri ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu SNP'lerin hastalığın farklı tipine nasıl neden olduğu tam olarak tanımlanmamıştır. Bu yaklaşımlardaki zorluklardan biri, genom çapında ilişki dizileri (GWAS) çalışmalarının fonksiyonel tahminde sınırlamalara sahip olmasıdır. Bu sorunu çözmek için, belirli missense mutasyonlarının CLOCK proteininin ve dolayısı ile sirkadiyen ritim üzerindeki etkisini göstermek adına, 1000 Genom Projesinde yer alan CLOCK SNP'lerini fonksiyonel olarak tanımlamak ve karakterize etmek için in vitro tekniklerini izleyen in-siliko çalışmaları kullandım. Bu tür sistematik yaklaşımlar, patolojik etkileri olan SNP'leri keşfetmemize ve bu SNP'lerin proteinlerin işlevini nasıl etkilediğini anlamamıza olanak sağlayacaktır.Bu tezde, Ensembl veri tabanından tanımlanan nadir CLOCK missense varyasyonlarının (p.Phe104Cys, p.Leu118Arg, p. Asp119Val, p.Gly120Val ve p.Phe121Cys) fonksiyonel açıdan karakterizasyonlarını gerçekleştirdim. Başlangıçta bu varyasyonları hesaplama araçlarını kullanarak analiz ettim. Sonuçlar, varyantların CLOCK'un işlevsel olarak önemli bölgesinde yer aldığını ortaya koydu. In vitro deneysel yaklaşımı kullandım ve p.Leu118Arg, p.Asp119Val ve p.Phe121Cys CLOCK'un işlem etkinliğini azalttığını, p.Gly120Val CLOCK'un BMAL1 ile birlikte işlemi artırdığını gösterdim. Ancak, p.Phe104Cys CLOCK, karşılaştırılabilir transkripsiyonel aktiviteye sebep olmadı. CLOCK SNP'leri ve BMAL1 arasındaki afinite etkisini göstermek için, aralarında ortak immünopresipitasyon deneyi yaptım. Sonuçlar şunu gösterdi ki p.Leu118Arg, s. Asp119Val, p.Gly120Val CLOCK'lar BMAL1'e afiniteyi azaltmıştı ve ilginç bir şekilde p.Phe121Cys CLOCK, BMAL1'e afiniteyi artırmıştı. Daha geniş bilgi elde etmek için, CRY1'in p.Leu118Arg ve p.Phe121Cys CLOCK'larda baskılayıcı aktiviteyi azalttığını da gösterdim. Bu arada, MD simülasyonlarının tahmini bağlama enerjisi analizi biyokimyasal sonuçları destekledi ve bu tür SNP'lerin etkilerinin mekanizmasını incelemek için amino asid başına bağlanma enerjisi analizi kullanıldı. Toplu olarak, CLOCK'taki tek nükleotid değişikliklerinin bile CLOCK işlevlerini doğrudan etkilediğini keşfettim. Bu nedenle, CLOCK SNP'lerinin etkilerinin aydınlatılması, CLOCK'un sirkadiyen saat mekanizmasındaki yapı-işlevi için değerli bilgiler sağlayacak, daha ileri çalışmalar da saat bozulması ile ilgili hastalıklar yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine de yardımcı olacaktır.