Fosfor döngüsüne biyoteknolojik yaklaşımlar: Bacillus subtilis'de rekombinant fitaz üretimi

Fosfor (P) bütün canlılar için gerekli bir makro besin olarak sınıflandırılmaktadır. Büyüme, protein sentezi, onarım ve enerji kullanımı gibi birçok yaşamsal süreçte kilit rol oynamaktadır. Fosfat (P2O5), P'nin en yaygın inorganik formu, çoğunlukla fitik asit ya da fitat (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate) formunda bulunmaktadır, fakat bitkiler ve çoğu hayvan tarafından tüketilememektedir. Tarımsal alanlarda, P eksikliğini önlemek için yüksek seviyede inorganik fosfor gübresi kullanılmaktadır. Bu gübrelerin üretimi çoğunlukla fosfat kayalarına bağımlı olduğundan sürdürülemez bir stratejidir. Ayrıca, gübre kullanımı akuatik ortamlarda ötrofikasyona yol açmaktadır, bunun sonucunda ekosistem zarar görmektedir. Fitaz (3.1.3.8), fosfataz ailesinden bir enzim olup fitik asitin myo-inositol ya da daha düşük fosfat esterlerine hidrolize olmasını sağlamaktadır. P eksikliğinin giderilmesinde, özellikle mikrobiyal fitaz enzimi, gübre veya gıda/yem maddesi katkısı olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, çalışmalar hem fosfor döngüsüne hem de ilgili sektörlere katkıda bulunan yüksek verimli enzim üretimine odaklanmıştır. Bu çalışmada, hücre dışı protein salgılama özelliği nedeniyle Bacillus subtilis, recombinant fitaz üretimi için konakçı hücre olarak seçilmiştir. B. subtilis 168 suşundan klonlanan fitaz geni, proteaz yoksunu olan B. subtilis RIK1285 suşuna aktarılmıştır. Rekombinant proteinin hücre dışına lokalizasyonunda sinyal peptidlerinin önemi dikkate alınarak, farklı sinyal peptidleri ile hücre dışı en yüksek fitaz aktivitesi veren transformantlar elde edilmeğe çalışılmıştır. Fitaz aktiviteleri 0.03-0.3 U/mL arası değişkenlik gösteren toplamda yirmi dokuz tane B. subtilis transformantı elde edilmiştir. Seçilen rekombinant plazmidlerin sekanslama sonuçları, kolonilerin lipB ya da dltD sinyal peptidi içerdiğini ortaya çıkarmıştır. Ayrıca farklı büyüme ortamlarının karşılaştırması, besiyerinde bulunan pirinç kepeğinin enzim üretim verimini arttırdığını göstermiştir. Bu çalışma, rekombinant enzim üretim verimini arttırmak için sadece moleküler düzeydeki modifikasyonların değil, büyüme ortamı seçiminin de önemini vurgulamaktadır.