Helicobacter pylori enfeksiyonunda bakteriyel dış membran proteinlerinin incelenmesi

Helicobacter pylori enfeksiyonu dünya çapında en yaygın enfeksiyöz hastalıklardan biridir. Bu bakteri kronik gastrit, peptik ülser ve gastrik adenokarsinoma gibi gastrik hastalıklar ile ilişkilidir. Bakteriyal virülans faktörlerinin gastrik kanser gelişimindeki rolü ve patofizyolojik mekanizmalar araştırılmaktadır. H. pylori suşlarında CagA ve dış membran proteinleri (OMPs) virülans genlerindeki polimorfizmler hastaların klinik sonuçlarını etkilemektedir. H. pylori cagA ve OMPs omp6, omp13 (oipA), omp18, omp20 (alpA) gen ekspresyon görülme sıklığı ve düzeylerinin RT RT-PCR yöntemi ile saptanabilirliğini ve bu genlerin H. pylori enfeksiyonunda hastaların klinik, endoskopi ve histopatoloji bulguları ile ilişkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Gastrik biyopsi örneklerinden H. pylori'nin kültürü ve izolasyonunda farklı kültür besiyerlerinin etkinliğinin değerlendirilmesi, ayrıca stok ve indikatör besiyerlerinin geliştirilmesi de amaçlanmıştır. Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi, Gastroenteroloji Polikliniği Endoskopi Ünitesi'ne üst gastrointestinal sistem yakınması ile başvuran ve endoskopi endikasyonu konulan, toplam 179 hasta çalışmaya alındı. Antrum ve/veya korpus gastrik biyopsi örneklerine hızlı üreaz testi (HÜT) ve histopatoloji uygulandı. Antrum ve/veya korpus gastrik biyopsi örneklerinin kültürü ve antimikrobiyal duyarlılık testi yapıldı. İzole edilen H. pylori suşlarının klaritromisin duyarlılığı E-test yöntemi ile araştırıldı. Ellidokuz hastada farklı içerikli kültür besiyerleri ile H. pylori'nin optimal izolasyonu indikatörlü ve transport besiyerleri kullanılarak araştırıldı. Yüz yirmi hastanın 101'inde antrum ve/veya korpus gastrik biyopsi örneklerinde H. pylori cagA, omp6, omp13 (oipA), omp18 ve omp20 (alpA) genlerinin ekspresyon varlığı ve düzeylerinin saptanmasında gastrik biyopsi örneklerinden total RNA ekstraksiyonu yapıldı. cDNA sentezi ile cDNA'lar elde edildi. H. pylori omp6, omp13 (oipA), omp18, omp20 ve cagA genleri ayrıca house-keeping genlerinin ekspresyonu TaqMan RT RT-PCR yöntemiyle araştırıldı. Verilerin istatistiksel analizleri yapıldı ve değerlendirildi. Yüz yirmi hastanın HÜT ve histopatoloji bulguları her ikisi pozitif olan 48 (%40) hasta H. pylori enfeksiyonu pozitif saptandı. Antrum ve/veya korpus gastrik biyopsi örneklerinde HÜT testi uygulanan 120 hastanın 79 (%66)'u HÜT pozitif, 88 hastanın 63 (%72)'ü HLO pozitif saptandı. Sadece kültür yöntemi tek başına değerlendirildiğinde, 120 hastadan 104 hastanın 50 (%48)'si H. pylori kültür pozitif; HÜT ve histopatoloji ikisi birlikte pozitif 48 hastada 30 hasta H. pylori kültür pozitif saptandı. Kültür yönteminin duyarlılığı %86.0, özgüllüğü %90.0 saptandı. H. pylori enfeksiyonu endoskopik, histopatolojik ve demografik bulgular ile değerlendirildi. H. pylori enfeksiyonu görülme sıklığı açısından kadın ve erkek hastalar arasında, ayrıca ortalama yaş arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı (p=0.324, p=0.529). Histopatolojik bulgularda antrum ve korpusta H. pylori enfeksiyonu görülme sıklığı ile polimorfonükleer lökosit (PNL), mononükleer hücre (MNH) infiltrasyonu ve HLO düzeyleri arasında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde ilişki saptandı (p=0.006, p=0.001), (p=0.001, p=0.010) (p<0.001), ancak H. pylori enfeksiyonu görülme sıklığı ile intestinal metaplazi (İM) arasında anlamlı düzeyde ilişki bulunmadı (p=0.616, p=0.870). RT RT-PCR yöntemi ile çalışılan 101 hastanın antrum ve/veya korpus gastrik biyopsi örneklerinde iki house-keeping geninin birlikte Ct (eşik döngüsü) değeri saptandığında 77 (%76.0) hastada H. pylori RT RT-PCR gen ekspresyonu pozitif saptandı. RT RT-PCR yönteminin duyarlılığı ve özgüllüğü %94.0 ve %60.0 bulundu. cagA, omp6, omp13 (oipA), omp18, omp20 (alpA), 16S rRNA ve ureA genlerinin Ct değerleri saptandı. RT RT-PCR çalışmasında H. pylori NCTC 11637 standart suşunun subkültüründe de bu genlerin Ct değerleri elde edildi. Bu değerler gastrik biyopsi örneklerinden elde edilen değerlere göre daha düşük saptandı. HÜT ve histopatoloji bulgularının pozitif olduğu 48/120 hastada H. pylori enfeksiyonu pozitifliğine göre RT RT-PCR yöntemi ile pozitif saptanan 45 hastada H. pylori gen ekspresyon görülme sıklığı cagA, omp6, omp13, omp18 ve omp20 genleri için sırasıyla 30 (%66.7), 35 (%77.8), 37 (%82.2), 45 (%100.0) ve 37 (%82.2) saptandı. cagA geninin ekspresyon görülme sıklığı diğer dış membran proteinlerine göre daha düşük ve omp18 geninin tüm hastalarda ekprese edildiği saptandı. H. pylori enfeksiyonu pozitif olan 48 hastanın endoskopik bulguları gastrik ülser/erozyon (n=6), duodenal ülser/erozyon (n=6), eroziv gastrit (n=11) ve non-eroziv gastrit (n=25) saptandı. H. pylori gen ekspresyonu görülme sıklığı ile endoskopik bulgular arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmadı (p>0.05), ancak omp13 (oipA) geninin rölatif ekspresyon düzeyi (ΔCt) gastrik ülser/erozyonu olan ayrıca eroziv gastritli hastalarda, non-eroziv gastritli hastalara göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha düşük saptandı (p=0.005, p=0.045). Araştırdığımız genlerin ekspresyonunun görülme sıklığı ve düzeyleri ile histopatolojik bulgular arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmadı (p>0.05). Araştırdığımız genlerde ortalama Ct değeri antrumda, korpusa göre daha düşük saptandı. omp6 ve omp13 genlerinin rölatif ekspresyon düzeyleri (ΔCt) korpusta, antruma göre daha yüksek saptandı (p=0.014, p=0.026). %7 at kanlı, H. pylori selektif suplement (DENT) içeren Columbia Blood agar besiyerinde şeffaf gri koloniler, TTC'li indikatör besiyerinde izole edilen H. pylori suşlarının altın renkli koloniler oluşturmasıyla özgün H. pylori varlığı saptandı. RT RT-PCR yöntemi ile H. pylori virülans geni cagA'nın varlığının saptanmasının yanı sıra hem cagA geni hem de dış membran proteinlerinden omp6, omp13, omp18, omp20 genlerinin ekspresyon görülme sıklığı ve düzeylerinin belirlenmesinin, H. pylori enfeksiyonlu hastalarımızda araştırdığımız genlerin ekspresyonlarının hastaların klinik sonuçları üzerinde istatistiksel anlamlı etkisi olmadığı saptandı. H. pylori enfeksiyonu patogenezinde inflamatuvar ve adezin proteinini kodlayan omp13 geninin önemli bir rolü olabileceği düşünüldü. Antrum ve korpus arasında omp6 ve omp13 gen ekspresyon düzeylerinde görülen farklılıklar klinik açıdan önem taşıyabileceği düşünüldü. RT RT-PCR testinin güvenilir bir yöntem olarak H. pylori enfeksiyonu patogenezi ile ilgili gen ekspresyon çalışmalarında kullanılabileceği, ancak daha fazla hasta sayısı ile çalışılması ve daha ileri moleküler yöntemlerin yer alması kanısına varıldı. Anahtar kelimeler: Helicobacter pylori, dış membran proteinleri, cagA, gen ekspresyon, RT RT-PCR