İnsan PON1 enziminin saflaştırılması, manyetik kitosan nanopartikülleri üzerine immobilize edilmesi, metal hibrit nano yapılarının hazırlanması ve bazı ilaçların enzim sistemleri üzerine etkilerinin in vitro olarak araştırılması

Yaptığımız çalışmada; Paraoksonaz enzimi üçlü faz ayırma tekniğine (ÜFA) göre insan serumundan saflaştırıldı. Saflaştırma işlemi üç aşamada gerçekleştirildi. İlk olarak insan serumu, %60-80 amonyum sülfat doygunluğuna maruz bırakıldı. İkinci aşamada, elde edilen çökelek 3 mM Gilisin tamponunda (pH: 8.0) çözüldükten sonra sabit n-bütanol konsantrasyonunda 1.0:0.5, 1.0:1.0, 1.0:1.5, 1.0:2 oranlarında muamele edildi ve en yüksek aktivite 1.0:0.5 oranında tespit edildi. Üçüncü aşamada ise; birinci basamaktan elde edilen çökelek aynı tamponla çözüldükten sonra belirlenen n-bütanol oranı ile amonyum sülfatın %20, %25, %30, %35, %40, %45, %50 konsantrasyonlarında tekrar çöktürme işlemi yapıldı ve en yüksek aktivite %20 amonyum sülfat konsantrasyonunda belirlendi. Paraoksonaz (PON1) enzimi insan serumundan %76.4 verimle, 304.5 kat saflaştırıldı. Sonra, demir-manyetik kitosan nanopartikülleri hazırlandı ve paraoksonaz enzimini bu nanopartiküller üzerine kovalent olarak immobilize edildi. Bu yöntemde ilk olarak, kitosanın yüzeyi Fe3O4 nanopartikülleri ile kaplanarak manyetik hale getirildi. Daha sonra, glutaraldehit ara kolu bağlantısı ve kitosan moleküllerine kovalent olarak bağlandı. En son aşamada ise; Fe3O4-kitosan NP'leri üzerine PON1 enzimi L-glutaraldehit ara kolu üzerinden immobilize edildi. İmmobilize enzimin bağlanma yüzdesi %82.9 ve katalatik etkinliğinin artması ise %2.30 oranında olduğu belirlendi. Ardından, nano çiçek PON1-Ca2+ hibrit yapısı sentezlendi. Hibrit PON1 nano çiçeği tek adımlık bir yöntemle hazırlandı. Hibrit enzimin bağlanma yüzdesi ise %77.19 ve katalitik etkinliğin artması %26.4 olarak belirlendi. Elde edilen nano çiçek hibrit yapılarının toksisitesinin belirlenmesi amacıyla zebra balığı kullanıldı ve hibrit yapının herhangi bir toksisite göstermediği belirlendi. Ayrıca immobilize ve nano çiçek PON1 hibrit yapılarının karakterizasyonu için SEM, TEM, EDX, FT-IR ve XRD analizleri ayrı ayrı yapıldı. Daha sonra serbest, immobilize ve hibrit insan PON1 enziminin karakterizasyon (optimum pH, stabil pH, optimum sıcaklık, stabıle sıcaklık, Vmax, KM vd.) çalışmaları yapıldı ve katalitik etkinlikleri birbiriyle karşılaştırıldı. Çalışmanın son aşamasında ise; immobilize ve hibrit PON1 enzimlerinin aktiviteleri üzerine bazı ticari antilipit ilaçlarının (Valerik asit, Fenoksi – izobutirik asit, N-desmetil rosuvastatin) ve bazı antioksidan bileşiklerinin (Gallik asit, kuersetin, pirogallol, askorbik asit) etkileri araştırıldı. İnhibisyon kinetikleri (IC50 ve Ki değerleri) belirlendi.