Site-directed mutagenesis of Bile Salt Hydrolase (BSH) from Lactobacillus plantarum B14 and substrate specificity analysis of Mutant BSH enzymes

Safra asidi (SA) dekonjugasyonu, kolilglisin hidrolaz (KGH) ailesinin bir üyesi olan ve bağırsak bakterileri tarafından üretilen safra tuzu hidrolaz (STH) enzimi tarafından katalize edilir. Klinik olarak önemli olan STH, glikoz metabolizması, enerji homeostazı ve lipid emilimi ile ilgili SA aracılı sinyal yollarını değiştirir. Bununla birlikte, STH'ler kaynaklar arasında farklı safra tuzlarına karşı çeşitli substrat tercihleri sergilemektedir. STH üzerine yapılan kayda değer araştırmalara rağmen, STH substrat tanıma ile ilgili moleküler mekanizmalarının araştırılması sınırlı kalmıştır. Bu araştırma, Lactobacillus plantarum B14'ün STH enziminin (LpSTH) substrat özgüllüğü ile onun lup II bölgesinde bulunan V58 ve Y65'teki iki kalıntının arasındaki ilişkiyi analiz etmeyi amaçlamaktadır. Bu kalıntılar sırasıyla alifatik-hidrofobik ve aromatik-hidrofobik özelliklere sahiptir. V58 ve Y65 yerine sırasıyla M58, F58, N58, F65, L65 ve C65 aminoasitlerini ikame etmek için PCR tabanlı bölgeye yönelik mutagenez kullanılmıştır. Mutant rekombinant LpSTH'ler (mrLpSTH'ler) E. coli'nin BLR (DE3) suş'unda ifade edilmiş ve mrLpSTH'lerin altı farklı SA'ya karşı aktivitesi, belirlenmiştir. Çalışma, lup II'deki V58 ve ağırlıklı olarak Y65 kalıntılarının, substrat özgüllüğü ve katalizden sorumlu yapısal bölgede hayati bir rol oynayabileceğini göstermiştir. Sonuçlar, LpSTH'nin V58 ve Y65 kalıntılarının substrat özgüllüğüne dahil olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, STH'nin substrat özgüllüğünü aminoasitlerden ziyade kolat grubunun belirleyebileceği gözlenmiştir. Bununla birlikte, BSH'lerin yapısı ve substrat özgüllüğü ilişkilerini anlamak için diğer KGH ailesi üyeleri üzerinde mutagenez temelli daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir. Elde edilen sonuçlar, STH'lerin, kolatın steroid çekirdeğinde ve amino asit gruplarında safra asitlerini tanımlama yeteneğini geliştirmiş olması ihtimalini desteklemektedir. Sonuç olarak, bağlanma için tek gerekliliğin, kolat kısımlarının ve amino asitlerin substrat bağlama ceplerini uygun şekilde eşleştirmesi ve tamamlaması olabileceği muhtemel görünmektedir.