Microcystis aeruginosa toksik peptidlerinin kromatografik analizi ve epitel hücreleri üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi

Artan dünya nüfusuna bağlı olarak, özellikle içme suyu kaynaklarının güvenliği ve kalitesi son yıllarda dünya genelinde büyük önem arz etmeye başlamıştır. Siyanobakterilerin suda bulunuşu ve toksik bileşenlerinin tanımlanması öncelikli araştırma konuları haline gelmiştir, çünkü insan ve tüm canlı organizmalar üzerindeki toksik ve öldürücü etkilerinin önüne geçilmesi için bu verilerin elde edilmesi gereklidir. Ayrıca siyanobakteriyel kontaminasyondan kaynaklanan patolojik süreçleri önlenmek veya tedavi etmek üzere etkili stratejiler geliştirmek için toksik maddeler ve etki mekanizmaları tam olarak aydınlatılmalıdır. Dünya genelinde neredeyse tüm tatlı su kaynaklarında yaşayan siyanobakterilerden Microcystis aeruginosa ile yapılan çalışmalar, bu türün diğer alg türlerine göre daha yüksek toksisiteye neden olduğunu göstermiştir. Bu toksisite başta insan ve hayvanlar olmak üzere tüm canlıların yaşamını tehdit etmektedir. Toksik bileşenler, sulama sırasında absorbsiyon yoluyla bitki dolaşım sistemine girmekte ve buna bağlı olarak sadece kontamine olmuş suyun kullanımı ile değil, bu su ile sulanmış bitkilerin tüketimi ile de besin zincirine katılmaktadır. Microcystis aeruginosa'da yüksek hepatotoksik aktivite gösteren birçok peptid tanımlanmıştır. Bu toksik peptidler genellikle hücre içinde tutulmakla beraber, hücre lizizine bağlı olarak veya aktif taşıma sistemleri ile hücre dışına da salınmaktadır. Beslenme yoluyla alınan toksik peptidler, organik anyon transport proteinleri ile karaciğere taşınıp protein fosfataz 1 ve protein fosfataz 2A enzimlerini inhibe ederek, hücre içi fosfoprotein artışına ve buna bağlı intrahepatik kanamaya, hücre nekrozuna ve karaciğerde tümör oluşumuna sebep olmaktadır. Bu çalışmanın amacı, toksik peptidler ve proteinler içeren Microcystis aeruginosa ekstresinin ve kromatografik olarak ayrılmış fraksiyonlarının insan epitel hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerini değerlendirmektir. Çalışmanın ilk aşamasında, kültürdeki Microcystis aeruginosa hücrelerinden total ekstre hazırlandı. Daha sonra bu ekstre yüksek performans sıvı kromatografi (HPLC) yöntemiyle 8 fraksiyona ayrıldı. Total ekstre ve fraksiyonların farklı konsantrasyonları logaritmik büyüme evresinin ortasında ECV304 hücreleri üzerine 48 saat süreyle uygulandı ve konsantrasyona bağlı olarak hücre canlılığı üzerindeki etkileri istatistiksel açıdan değerlendirildi. Ayrıca, total ekstrede ve her bir fraksiyonda bulunan polipeptidlerin molekül ağırlıkları sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforeziyle analiz edildi. En yüksek toksik etkiyi (~%70), beklendiği gibi total alg ekstresi gösterdi. Fraksiyonların hücre çoğalması üzerindeki etkileri birbirinden farklılık gösterdi. Bazı fraksiyonlar (1, 2, 4, 5 ve 6 no.) sitotoksik etki ortaya koyarken (sırasıyla, %55, %40, %40, %35 ve %30), bazı fraksiyonların özellikle düşük konsantrasyonları (3, 7 ve 8 no.) proliferatif etki (~%80-%5) gösterdi. Bu tez, Microcystis aeruginosa ekstresindeki toksik peptidlerin HPLC ile ayrımını ve her bir fraksiyonun ayrı ayrı sitotoksik etkisini rapor eden ilk çalışmadır. Epitel hücreleri üzerindeki en yüksek sitotoksik aktivitenin total alg ekstresinde belirlenmiş olması, farklı fraksiyonlarda bulunan polipeptidlerin sitotoksisiteye sinerjik katkı sağladığını düşündürmektedir. Elektroforetik analizler total ekstre ve fraksiyonlarının geniş bir molekül ağırlığı aralığında (5-300 kDa) ortak veya farklı polipeptidler içerdiğini ortaya koymuştur. Bu sonuçlar, Microcystis aeruginosa'ya bağlı toksisitenin önlenmesinde ve tedavisinde hedeflenecek toksik moleküllerin belirlenmesi açısından önem arz etmektedir. Bu çalışmada optimize edilen HPLC prosedürü, Microcystis aeruginosa'nın ve diğer alglerin toksik peptidlerinin analizi için gelecekte yürütülecek çalışmalarda yol gösterici olabilir. Gelecek çalışmalarda Microcystis aeruginosa'daki toksik peptidleri daha iyi tanımlayabilmek için, total alg ekstresi yerine bu ekstreden çöktürülerek ayrılan total proteinlerin referans toksik peptidlerle birlikte kullanılması daha iyi sonuç verebilir. Ayrıca fraksiyonlardaki toksik peptidleri daha belirgin bir şekilde görüntüleyebilmek için peptidlere özel 1- ve 2-boyutlu PAGE sistemleri kullanılmalıdır.