Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve insan epidermal büyümefaktörü reseptörü 2 (HER2) tirozin kinaz domainlerinin ilaç keşfine yönelik yapı-temelli çalışmalar için üretim, saflaştırma ve kristalizasyon stratejileri

Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) tirozin kinaz domainleri (TKD), hücresel sinyal iletiminin kritik düzenleyicileridir ve kanser progresyonunda merkezi bir rol oynarlar. Bu nedenle, EGFR- TKD ve HER2-TKD'nin yapısal olarak incelenmesi, yapı-temelli ilaç keşfi çalışmalarında büyük önem taşımaktadır. Bu tez kapsamında, rekombinant EGFR-TKD ve HER2-TKD'nin üretimi, saflaştırılması ve ilk kristalizasyon denemeleri gerçekleştirilmiştir. İlgili genler pET28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanmış ve Escherichia coli'de eksprese edilmiştir. İlk denemelerde proteinlerin büyük kısmı inklüzyon cisimcikleri halinde elde edilmiştir; ancak sarkosil kullanımı ile başarılı bir şekilde çözünür hale getirilmiştir. Verim ve çözünürlüğü artırmak amacıyla sıcaklık, indükleyici konsantrasyonu ve indüksiyon süresi gibi koşullar optimize edilmiştir. Saflaştırma aşamalarında boyut-ayırma kromatografisi ve SUMO etiketinin uzaklaştırılması için ters afinite adımı kullanılmıştır. Bu yöntemlerle kristalizasyona uygun proteinler elde edilmiştir. Optimizasyon sonrası her iki proteinin çözünür formları elde edilmiş, EGFR-TKD için ilk kristaller başarıyla büyütülmüş, HER2-TKD için ise kristal kalitesini artırmaya yönelik çalışmalar devam etmektedir. Bu sonuçlar, gelecekte yapılacak ilaç tarama çalışmaları ve yeni inhibitörlerin geliştirilmesi için güçlü yapısal platformlar sunmaktadır.