Sitomegalovirüs spesifik T hücre yanıtının flow sitometri yöntemi ile optimizasyonu

Human Herpesvirüs 5 (HHV-5) olarak tanımlanan insan Sitomegalovirüs (Cytomegalovirüs : CMV), Herpesviridae ailesinin Betaherpesvirinae alt ailesinde Cytomegalovirus cinsi içerisinde yer alır. CMV, primer enfeksiyondan sonra endotelyal hücreler, lökositler ve çeşitli dokularda latent enfeksiyonlara neden olur. Organ naklinde verici CMV seropozitif (D +), alıcı seronegatif (R-) ise nakil alan hastalarda primer CMV enfeksiyonu; CMV seropozitif alıcılarda ise CMV reaktivasyonu ve reenfeksiyon gelişme riski yüksektir. Latent virüs enfeksiyonları transplantasyon alanında immün süpresif tedavi ile sağlanan başarıyı olumsuz yönde etkileyen en önemli faktörlerdendir. Bu nedenle nakledilen organın reddi hatta hastanın kaybı ile sonlanabilen CMV enfeksiyon hastalığının zamanında saptanması son derece önemli ve gereklidir. CMV enfeksiyonu tanısında hücre kültürü, histopatolojik inceleme, serolojik testler, moleküler yöntemler, CMV antijenemi testi ve immünolojik testler gibi geniş bir yelpazeye yayılan testler kullanılmaktadır. Hücre kültürü, CMV tanısında altın standard kabul edilse de günümüzde yerini daha hızlı sonuç veren, daha az emek ve iş gücü gerektiren testlere bırakmıştır. Nitekim günümüzde solid organ transplant hastalarında CMV enfeksiyonunun belirlenmesinde preemptif tedavi uygulanacak hastaların seçiminde ve tedavinin izleminde moleküler yöntemler ile viral yükün saptanması ve kantitasyonu pratik uygulamada yerini almıştır. Özellikle immün sistemi baskılanmış olgularda ve latent virüs enfeksiyonlarında konağın etkene yanıtı ya da yanıtsızlığı klinik tablonun belirlenmesinde anahtar rol oynar. Viral enfeksiyonlardan korunmada özellikle hücresel bağışıklık yanıtının önemi büyüktür ve hafıza CD4+ ve CD8+ T lenfositler hücresel immünitenin fonksiyonel imzalarıdır. Organ nakil hastalarında, etkenin özellikleri yanı sıra konak immün yanıtının bilinmesi, enfeksiyon hastalığının daha erken saptanmasını, immün süpresif tedavinin ve enfeksiyon tedavisinin monitörizasyonunu sağlayacaktır. Hücresel anti-viral immünite en yaygın olarak ELISPOT, Quantiferon ve akış sitometri yöntemleri ile çalışılmaktadır. Araştırmamızda kullandığımız sitokin akış sitometri yöntemi ile hücreleri büyüklük ve granülaritelerine göre birbirinden ayırmanın yanı sıra fonksiyonlarını da ölçmek mümkündür. Akdeniz Üniversitesi Hastanesi?nin güçlü yanlarından birisi organ naklinde göstermiş olduğu başarıdır. Bu başarı biz laboratuvar bilim dallarına da organ nakil hastalarında enfeksiyon hastalıklarının tanısı ve izleminde evrensel- bilimsel yaklaşımları takip etmek sorumluluğunu yüklemektedir. Biz de sorumluluğumuzun bilinci ile laboratuvarımızda organ nakil hastalarında virus spesifik hücresel yanıt araştırmalarına başlamış bulunuyoruz. Araştırmamızda, böbrek nakli yapılmış hastalarda CMV?ye spesifik T hücre yanıtını sitokin akış sitometri yöntemi ile optimizasyon ve validasyonunu ve ardından klinik olguların hücresel immün yanıtlarının monitörizasyonunu planladık. Bu amaçla Aralık 2012- Ağustos 2013 tarihleri arasında Akdeniz Üniversitesi Organ Nakli Merkezi tarafından canlı vericiden böbrek nakli planlanan, 18-66 Y (kısaltma yapma veya ilk yaptıgında ne oldugunu yaz) yirmi bir (7 K, 14 E) hastadan böbrek nakli öncesi ( 0.ay) ve nakil sonrası 1., 3. ve 6. aylarda toplam dörder kez örnek aldık. Prospektif araştırma sürecinde on iki hastanın planlanan tüm örnekleri alınmış ancak dokuz hastanın transplantasyon sonrası 6.ay örneklerini almak için projemizin süresi yeterli olamamıştır. Kontrol grubu olarak böbrek nakli planlanan hastaların sağlıklı, CMV seropozitif vericilerinden (24-66 Y, 10 E ,10 K) örnek alınmıştır. Çalışmamızın optimizasyon ve validasyon testlerinin tamamlanmasının ardından hastalarımızın ve kontrol grubumuzun testlerini çalıştık. Yöntemimizin ana basamakları, tam kandan periferik kan mononükleer hücre (PKMNH) izolasyonu, dondurulup saklanması, çözülmesi, ardından lenfositlerin CMV peptidleri ile ex vivo olarak uyarılması ve CMV spesifik IFN-? üreten T lenfositlerinin yüzey antijenleri ve hücre içi sitokin boyama sonucunda akış sitometride fonksiyonel ayırım yaparak sayılmasıdır. Elde edilen ana bulgular IFN-? üreten CMV spesifik CD4+ , CD8+ ve toplam (CD4++CD8+) T lenfosit yüzdeleridir. Hastanın periferal kanlarındaki lenfosit sayılarıyla bu değerler oranlanarak periferal kanlarında bulunan CMV spesifik IFN-? üreten T lenfosit sayısı hesaplanmıştır ve değerlendirmeler bu sayılar üzerinden yapılmıştır. Tüm hastalar ve kontrol grubu için yapılan testler tamamlandıktan sonra elde edilen bulgular değerlendirildiğinde nakilden sonraki 3.ayda ölçülen periferal kan lenfositlerinin 1.ay değerlerinden anlamlı oranda düşük olduğu görülmüştür. CMV spesifik CD4+ 1.aydan da 3.aya (p=0,003) doğru anlamlı oranda azalma gözterdiği; diğer gruplar arasında anlamlı fark olmadığı saptanmıştır. CMV spesifik CD4+ +CD8+ T lenfosit 3.ay değerinin 1.aya göre anlamlı oranda (p=0,039) azaldığı belirlenmiştir. Hastaların nakil öncesinde test edilen CMV IgG değerlerinin, yaşlarının, cinsiyetlerinin, hastalara uygulanan immün süpresyon ve indüksiyon tedavilerinin IFN-? salınımı yapan CMV spesifik T lenfositler üzerinde anlamlı etkilerinin olmadığı görülmüştür. 6.ay örneğinde düşük düzeyde viremi saptanan olgumuzun 3.ayında CMV hücresel immün yanıtının olmadığı, 6 ayda ise yüksek düzeyde CMV spesifik IFN-? salınımının mevcut olduğu izlenmiştir. Sonuç olarak biz bu çalışma ile hastanamizde ve Türkiye?de ilk defa uygulanan, flow sitometrik yöntem ile böbrek nakli hastalarında CMV spesifik T hücre kantitasyonu yaptık. Optimizasyon ve validasyon çalışmalarımız sonucunda gördük ki altı aylık dondurulma süresinde bile virüs spesifik T hücre yanıtı kantitasyonu olumsuz etkilenmemektedir. Bu çalışma sadece solid organ transplantasyonu değil kemik iliği transplantasyonu alanında da yapılacak olan daha geniş kapsamlı çalışmlara öncü olacaktır