Termofilik geobacıllus Sp. TF16'dan ksilanazın klonlanması, ekspresyonu, immobilizasyonu, karakterizasyonu ve endüstriyel uygulamalarının incelenmesi

Bu çalışmada, Geobacillus sp. TF16 suşundan 996 bç'lik ksilanazı kodlayan genin baz dizilimi belirlendi ve bu DNA parçası pET-28a(+) vektörüne klonlandıktan sonra, Escherichia coli BL21(DE3)pLysS hücresine aktarılarak rekombinant ksilanaz ekspres edilip nikel afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. SDS-PAGE ile 39,8 kDa'luk tek bir bandın varlığı tespit edildi. Ayrıca enzimin amino asit benzerliğine göre familya 10 glikozil hidrolaz sınıfı bir enzim olduğu belirlendi. Serbest enzim dowexe %58,8, kitine %68,1 ve kitosana %85,6 verimle immobilize edildi. Serbest ve immobilize enzimin en yüksek aktiviteyi ksilan substratı varlığında gösterdi tespit edildi. Serbest enzimin optimum pH değeri 8,5 ve sıcaklığı 55°C, kitosana immobilize enzimin optimum pH değeri 6,0 ve sıcaklığı 65 °C olarak belirlendi. Saf enzimin ve immobilize enzimin Vmax değeri sırasıyla 30,86±0,96 µmol.dak-1.mg-1 ve 1,20±0,03 µmol.dak-1.mg-1 olarak bulunurken, K0,5 değerleri sırasıyla 1,75 mg/L ve 1,65 mg/mL olarak bulundu. Isıl ve pH kararlılığı incelendiğinde immobilize enzimin serbest enzime göre daha kararlı olduğu belirlendi. Serbest enzimin düşük konsantrasyonda bazı metal iyonları ve kimyasalların varlığında inhibisyona uğradığı, immobilize enzimin ise düşük konsantrasyonlardaki metal iyonları ve kimyasallardan etkilenmediği tespit edildi. Elma suyunda enzimin kullanılmasıyla indirgen şeker miktarı 1,03 kat, immobilize enzim kullanılmasıyla 1,05 kat artarken, portakal suyunda enzimin kullanılmasıyla indirgen şeker miktarı 2,84 kat, immobilize enzim kullanılmasıyla 3,23 kat arttığı belirlendi. Serbest enzimin kümes hayvanı yemiyle etkileşimi sonucunda indirgen şeker miktarındaki artış oranı %12,0 ve immobilize enzim varlığında indirgen şeker miktarındaki artış oranı %34,0 olarak bulundu. Ayrıca serbest enzimin hamur kabarmasını 2,7 kat artırırken, immobilize enzimin 5 kat artırdığı gözlemlendi.