2
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Termofilik bir aktinomiset olan Thermobifida fusca EFTS 7A suşundan selülaz geninin klonlanmasi ve rekombinant proteininin üretilmesi
Bu tezde, İzmir Eski Foça'da bulunan, bir mantar çiftliği kompostundan elde edilen bir izolat kullanılmıştır. Bu izolatın, ekstraselüler selülaz ve ksilanaz üretim kapasiteleri, Kongo Red ve Gram İyodür gibi tarama metodları ile modifiye Thermoactinomyces besiyerinde belirlenmiştir. İzolatın tanılanması, 16S rRNA gen bölgesine göre yapılmış ve Gen Bankası'ndaki baz dizisi çakışmasına göre Thermobifida fusca EFTS 7A olarak adlandırılmıştır. Ekstraselüler selülaz, β-glukosidaz ve ksilanaz aktiviteleri spektrofotometrik yöntemle ölçülmüştür. Enzimlerin optimum aktivite gösterdiği koşullar, çeşitli pH ortamları, farklı karbon, organik ve inorganik azot kaynakları denenerek tespit edilmiştir. Optimum şartlar altında en yüksek selülaz aktivitesi avicel subsuratı varlığında 7.günde 230,6 U/L ve en yüksek ksilanaz aktivitesi ise ksilan subsuratı varlığında 7.günde 1350,6 U/L olarak ölçülmüştür. En yüksek β-glukosidaz aktivitesi, gliserol ve sellobiyoz içeren ortamda 6.günde 203,3 U/L olarak belirlenmiştir. Klonlanması düşünülen selülolitik gen bölgesi, genomu oluşturulmuş Thermobifida fusca YX aktinomiseti baz alınarak belirlenmiştir. Seçilen bölge, Tfu_0901 (cel5A) olup bir endoglukanazdır. Klonlama çalışmalarında kullanılacak kit içeriğine uygun primer çifti tasarlanmıştır. Bu gen bölgesi PZR aracılığıyla izole edilmiş ve jelden ekstraksiyonu yapılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan bu PZR ürünü dizi analizine gönderilmiş ve diziler veritabanları ile karşılaştırılarak PZR ürününün ilgilenilen gen bölgesi olduğu belirlenmiştir. Klonlama için, gen bölgesi cel5A ve pKLAC2 vektörü restriksiyon enzimleri ile muamele edilmiş ve iki kesim ürünü tekrar saflaştırılıp ligasyon işlemi gerçekleştirilerek pKLAC2 vektörüne aktarımı tamamlanmıştır. Plazmit lineer ekspresyon kaseti oluşturmak için BstXI ile kesilmiş ve kompotent K.lactis GG79 hücrelerine lineer ekspresyon kaseti transforme edilmiştir. Petriler 5mM asetamid içeren YCB agar ortamında inkübe edilmiş ve zayıf koloni gelişimi gözlenmiştir. K.lactis GG799'a ait rekombinant selülaz aktivite ölçümleri DNS yöntemi ile 2.günde 50,4 U/L ve 3.günde 44,7 U/L olarak ölçülmüştür. Anahtar Kelimeler: Termofilik aktinomiset, selülaz, primer, PZR, restriksiyon enzimi, klonlama
Yabani makrofungus türlerine ait misellerin enzim üretim potansiyellerinin belirlenmesi
Bu çalışmada ülkemiz topraklarından toplanan 20 makrofungus türünden (Postia stiptica, Pleurotus ostreatus, Meripilus giganteus, Inocybe leiocephala, Stropharia inuncta, Armillaria mellea, Pleurotus sajor-caju, Lentinula edodes, Paxillus involutus, Pleurotus eryngii, Russula fellea, Inocybe flocculosa var. crocifolia, Ganoderma lucidum, Fomes fomentarius, Stropharia inuncta, Tricholoma caligatum, Pleurotus djamor) elde edilen misellerin enzim aktivite potansiyelleri araştırılmıştır. Çalışmamız Makrofungus suşlarına ait misellerin amilaz ve proteaz enzimlerinin üretim potansiyelleri açısından katı besiyerinde gerçekleşen enzim üretim tarama testi ve sıvı besiyerinde gerçekleşen enzim miktarı belirlenme testi olmak üzere iki ana kısımdan oluşmuştur. Katı besiyeri tarama testinde amilaz için beş, proteaz için on makrofungus pozitif olarak işaretlenmiştir. Sıvı besiyeri denemelerinde amilaz üretimi 22.50 U/ml en yüksek Armillaria mellea, proteaz denemeleri açısından ise 37.69 U/ml Meripilus giganteus en yüksek üretim değerlerini vermiştir. Çalışmamızın son bölümünde enzim üreten organizmaların optimum gelişim parametreleri belirlenmeye çalışılmıştır. Bu amaçla farklı karbon kaynağı içeren katı besiyerine aşılanan organizmalarn gelişimi misel büyüme hızlarının düzenli ölçülmesi ile farklı pH ve sıcaklık değerleri kullanılarak yapılmıştır. Bunun sonucunda; Armillaria mellea miselleri; karbon kaynağı olarak sükroz içeren besiyerinde 250C' de ve pH 6.0'da optimum gelişim göstermiştir. Meripilus giganteus miselleri ise; fruktoz içeren besiyerinde, 250C' de ve pH 5.5' de optimum koloni gelişimi sergilemiştir.