Cloning of 32-mer MaSP1 Gene into pBbB6c plasmid vector and transformation to Escherichia coli neb 10-beta

Tezimin temel amacı, dragline tipi örümcekten Masp1 örümcek ipek proteini kodlayan geni E.coli NEB 10-beta organizmasına klonlamaktı. Örümcek ipeği proteininin rekombinant mikrobiyal üretimi ve bunun bir elyaf formatına dönüştürülmesi, sonuçta Kevlar, çelik ve karbon elyafına kıyasla düşük yoğunluklu, yüksek tokluğa ve esnekliğe sahip biyoçelik olarak da adlandırılan bir biyomateryal üretecektir. Bu amaçla, dragline örümcek proteinini (MaSP1) kodlayan gen, rekombinant moleküler yöntemler kullanılarak E. coli NEB 10-beta'ya klonlanmıştır. İlk olarak, 8-mer MaSP1 sentezlendi ve pGSI yüksek kopya klonlama vektörü yoluyla, KpnI,Kpn2I kesim enzimleri ile yapışkan uç kesimi ve ardından E.coli'ye ısı şoku dönüşümü yoluyla klonlandı. İkinci olarak, 8-mer'i çıkarmak için 8-mer plazmitinin Nhel ve Kpn2I ile kesimini gerçekleştirdik. Daha sonra, 8-mer Masp1 içeren doğrusallaştırılmış pGSI için SpeI ve Kpn2I ile kesim gerçekleştirildi. pGSI içeren 16-mer Masp1 elde etmek için 8-mer ve 8-mer Masp1 taşıyan pGSI plazmitini birleştirmek için bir ligasyon uygulandı. Yine bu plazmit ısı şoku ile E.coli'ye dönüştürüldü. Aynı kısıtlamanın ardından, pGSI plazmidi içeren 32-mer Masp1 elde edildi. Son olarak, 32-mer Masp1 fragmanı, pGSI klonlama vektöründen kesildi ve pBbB6c düşük kopya ekspresyon plazmitine bağlandı, ardından E.coli'ye elektroporasyon yapıldı. 32-mer Masp1 geninin bant boyutu, bir anlaşma olan 3 kb ile 5 kb arasında hizalandı. 32-mer Masp1 geninin hesaplanan boyutu ile. Gelecekteki çalışmalar, Masp1'in ekspresyonuna ve bu rekombinant proteinin biyoreaktör koşulları altında en son biyoişleme teknikleriyle verimli üretimine odaklanmalıdır.