Development and validation of methods for the diagnosis of lung cancer via serological biomarkers

Yeni tespit edilen kanser vakalarının %10'u akciğer kanseridir. Dahası 2030 için yapılan öngörüler halihazırda artmakta olan akciğer kanseri vakalarının tüm dünyada ve özellikle Türkiye gibi gelişmekte olan ülkelerde daha da artacağını göstermektedir. Şu an en ölümcül kanser tipi olan akciğer kanserinin alt tipleri iki başlık altında toplanır: Küçük Hücreli Akciğer Kanseri (KHAK) ve Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri (KHDAK). KHAK akciğer kanserinin en agresif tipidir. Erken Aşama (EA) hastalıkta tedavi seçenekleri ve ortalama hayatta kalma süreleri daha çok olmasına karşın, KHAK'deki hızlı tümör büyüme hızı ve hastalığın çok hızlı metastaz yapma eğilimi erken teşhisi zorlaştırmaktadır. Benzer şekilde KHDAK'de da Erken Aşama hastalıkta cerrahi operasyon seçeneğinin mümkün olması dolayısıyla hasta hayatta kalma oranı artmaktadır. Fakat şu an tarama ve erken teşhiste kullanılan Bilgisayarlı Tomografi (BT) ve Pozitron Emisyon Tomografisi (PET) gibi yöntemler verdikleri sonuçlarda yüksek hatalı pozitiflik olması sebebiyle yetersizdir. Ek olarak tümör cinsini tespit ederken histolojik değerlendirmede kullanılan biyopsi yöntemleri hem hasta için invazivdir hem de örnekleme hataları dolayısıyla verdikleri sonuçlar yüksek hatalı negatiflik içerebilmektedir. Bu yüzden teşhiste kullanılmak üzere ucuz, hassas ve invaziv olmayan yöntemlere büyük ihtiyaç bulunmaktadır. Otolog antikorlar kanserin klinik teşhisinden yıllar önce hasta serumunda bolca ve yüksek stabilitede bulunmaktadır. Akciğer kanserinde bu tür antikorların varlığına hem bizim grubumuz hem de diğer bilimsel çevrelerce değinilmiştir. Dolayısıyla otolog antikorların ölçümüne dayalı teşhis yöntemleri akciğer kanserinin erken teşhisinde büyük gelişmeler sağlayabilecek potansiyel içermektedir. Bunun dışında miRNA'lar vücutta yaptıkları hormon benzeri etkiler, serumda sirkülasyonları ve hücrelerdeki düzenleyici etkileriyle akciğer kanserinin erken teşhisinde kullanılabilecek bir diğer adaydır. Bu sebeplerle, çalışmamda labımızda yapılmış cPA çalışmalarının tekrar değerlendirilmesi için güvenilir ve otomatize bir değerlendirme yöntemi geliştirmeyi amaçladım. Ek olarak, daha sonra cPA sonuçlarının doğrulamasında kullanılmak üzere QCM temelli bir immünosensör geliştirmeyi planladım. Son olarak, bunlara paralel bir çalışmada KHDAK'nin erken teşhisinde kullanılmak üzere miRNA temelli biyobelirteç tespit ve doğrulama çalışmaları yapmayı planladım. Aldığım sonuçlar cPA'ların ELISA'ya kıyasla daha iyi hassaslık ve özgünlük değerlerine sahip olabileceğine ve ELISA'ya alternatif olarak QCM-D temelli yöntemlerin geliştirilebileceğine işaret etmektedir. Ayrıca in silico tespit ettiğim miRNA'ların ex vivo validasyonu mümkündür. Labımızda gerçekleştirilen öncül çalışmalarda cPA ile 49 KHAK hastasına ve 50 sağlıklı kontrole ait serumlar taranmış ve sonuçları manuel ve görsel şekilde değerlendirilmişti. Bu çalışmada tek tek otolog antikorların ve bazı otolog antikor panellerinin hassaslık ve özgüllük değerleri hesaplanmıştı. Daha sonra cPA çalışmaları ELISA yöntemi ile doğrulanmıştır. Fakat cPA ve ELISA sonuçları arasındaki bazı büyük uyumsuzluklar ve ELISA yöntemi ile alınan ölçümlerin kendi içinde çelişkiler barındırması bu çalışmayla cPA sonuçlarının daha stabil bir yöntemle tekrar değerlendirilmesinde ve otolog antikorları ölçmede ELISA'dan daha başarılı bir yöntem geliştirme çabamda teşvik edici sebep oldu. Bu yüzden AIDA ile cPA tarama görüntülerinden numerik ölçüm değerleri elde edip düşük kalite sinyallerin belli bir eşik değer ile elimine edilmesi sağlandı. Elde edilen veriler kullanılarak çok sayıda ROC eğrisi çizildi. Çizilen tekli otolog antikor ve panel ROC eğrilerindeki artan AUC değerleri uyguladığımız yeni değerlendirme yönteminin başarısı gösterdi. Ayrıca bu çalışmada anti-SOX2 antikorunu PBS solüsyonundan ölçebilen QCM temelli bir biyosensör geliştirildi. Bu yöntemin daha sonra cPA sonuçlarını doğrulamada kullanılması planlanmakta. SOX2 ile anti-SOX2 arasındaki bağlanma etkileşimi QCM standart eğri değerlerinin 1:1 Langmuir İzotermal Bağlanma modeline oturtulmasıyla incelendi. Bunlara paralel ve ek olarak KHDAK'de yüksek riskli kontrollere kıyasla anlamlı şekilde yukarı yönlü değişen miRNA'lar incelendi. Bunun için miRNA ekspresyon datasetleri GEO sitesinden belirlendi. Bunların içinden aynı örnek tipine sahip 2 KHDAK dataseti seçilip bu iki datasette de ekspresyon değerleri anlamlı ve yukarı yönlü değişim gösteren miRNA'lar gerekli analizlerle tespit edildi. Tespit edilen miRNA'lar lojistik regresyon ve LASSO düzenlileştirme yöntemleriyle (Hata metriği: AUC ve MSE) analiz edilip hastaları kontrollerden ayırmada en başırılı olan miRNA paneli seçildi. Seçilen miRNA paneli için qRT-PCR ile doğrulama çalışması yapıldı. cPA görüntülerinden AIDA programıyla elde edilen sayısal değerlerdeki düşük kaliteli verileri başarılı bir şekilde eleyip cPA sonuçlarını tekrar değerlendirebildim. 4 otolog antikordan (FKBP8 – P53 – SOX2 – POLB) oluşan bir panel belirledim. Belirlenen panelin KHAK hastalarını kontrollerden ayırma gücü %100 özgüllükte %60 hassasiyet olarak belirlendi. Bu panel için çizilen ROC eğrilerinin AUC değeri %95.04 olarak hesaplandı. Bahsi geçen panelin teşhis gücü halihazırda piyasada bulunan benzer tek kit olan EarlyCDT-Lung kitinin teşhis gücünün üstünde yer aldı. Anti-SOX2 antikoru ve SOX2 proteini imunojenik çiftini kullanarak PBS solüsyonunda gerçekleştirilen QCM ölçümleriyle bu yöntemin otolog antikorların ölçülmesinde kullanılabilirliği gösterildi. Ön çalışmalar anti-SOX2 mAb QCM yönteminin lineer ölçüm aralığının ELISA ile kıyaslanabilir seviyelerde olduğunu gösterdi. QCM anti-SOX2 yöntemiyle alınan ölçümlerin 1:1 Langmuir Izotermal Bağlanma modeline oturtulmasıyla kullandığım antijen antikor çifti arasında güçlü bir bağlanma etkileşimi tespit edildi. Ayrıca lojistik regresyon ve LASSO düzenlileştirme yöntemiyle KHDAK hastalarını yüksek risk kontrollerden en iyi ayıran 5 miRNA tespit edildi. Fakat, qRT-PCR doğrulama deneylerinde elde edilen düşük Ct değerleri ve serumlarda tespit edilen yüksek hemoliz değerleri dolayısıyla deney sonuçlarından anlamlı çıkarımlar yapmak mümkün olmadı. Dolayısıyla yapılan doğrulama deneylerinin tekrarlanması gerekmektedir. Anahtar Kelimeler: Akciğer kanseri, KHAK, KHDAK, özel yapım protein mikrodizilim, serum, serolojik, otolog antikor, miRNA, biyobelirteç, ELISA, QCM, ROC, hassaslık, özgüllük, lojistik regresyon, LASSO, qRT-PCR