Antikanser taksanların fındık (Corylus avellana) hücre kültürlerinde biyoteknolojik üretimi

Paklitaksel, 1971 yılında Taxus brevifolia (Porsuk ağacı) kabuğundan izole edilmiş ve Taxol® ticari adı altında anti kanser ilaç olarak kullanımı FDA tarafından onaylanmış önemli bir terapötiktir. Taxol® (Paklitaksel), günümüzde çeşitli tipteki tümörlerin tedavisinde başarılı bir biçimde kullanılmaktadır. Paklitaksel, diterpen alkoloid grubu bir sekonder metabolittir. Sekonder metabolitler genel olarak bitkilerin stres faktörleriyle mücadele etmelerinde görevli düşük molekül ağırlıklı bileşiklerdir. Sekonder metabolitlerin üretim ve saflaştırılması zorlu ve karmaşık süreçler gerektirir. Paklitaksel ekstraksiyonunun verimli bir protokol ile gerçekleştirilebilmesi için birçok yöntem denenmiştir. Kimyasal sentez, yarı sentez, metabolizma mühendisliği, bitki doku kültürü tekniklerinin kullanılması bu yöntemlerin en önemlileridir. Taxol® üretiminde halen kullanılmakta olan yöntem, Taxus türlerinin hücre kültürleri ile üretimdir. Üretim hızının artırılması, verimin yükseltilmesi, paklitaksel öncüllerinin üretimi ve istenmeyen yan ürün oluşumunun ortadan kaldırılması gibi amaçlar için alternatif bitkilerin kültür sistemlerinin kurulması büyük umut vadetmektedir. Fındık (Corylus avellana) Türkiye'de büyük miktarlarda üretimi ve ihracatı yapılan, besin değeri nedeniyle insan diyeti için oldukça önemli bir bitkidir. Ekonomik öneminin yanı sıra, fındığın paklitaksel türevi taksanları üretebildiği gösterilmiştir. Bu tez çalışması kapsamında ülkemizde yetiştirilen 5 farklı çeşit (Tombul, Sivri, Çakıldak, Palaz, Kalınkara) ve 2 farklı genotipteki (Ham ve Sivri Yağlı) fındığın bitki doku kültürü sistemleri kullanılarak taksan türevi antikanser maddelerin (paklitaksel, bakkatin III, 10-deasetil bakkatin III ve sefalomannin) biyoteknolojik üretimine yönelik potansiyellerinin araştırılması hedeflenmiştir. Bu hedef doğrultusunda tüm fındık çeşit ve genotiplerinde kallus kültürleri, Tombul ve Kalınkara fındıklarda da hücre süspansiyon kültürleri başarıyla kurulmuştur. Hücre süspansiyon kültürlerinde taksan türevi antikanser maddelerin üretiminin artırılması amacıyla hücre süspansiyon kültürlerine Metil Jasmonat (MeJa) ve Fenil alanin (Phe) ile elisitasyon uygulaması yapılmıştır. Elisite edilen kültürlerde bulunan toplam ve hücre dışına salınan paklitaksel, bakkatin III, 10-deasetil bakkatin III ve sefalomannin miktarları HPLC ile analiz edilmiştir. Kallus kültürlerinin kurulması amacıyla MS besiyerine eklenen 2 mg/L 2,4-D + 0,4 mg/L KİN, 2 mg/L 2,4-D + 1,6 mg/L KİN ve 2 mg/L 2,4-D+ 0,2 mg/L BAP bitki büyüme düzenleyicilerinden kallus kültürleri oluşturmada tüm fındık tiplerinde en etkili olan kombinasyonun 2 mg/L 2,4-D+ 0,2 mg/L BAP olduğu (Sivri Yağlı- %50, Ham- %46, Tombul- %36, Sivri- %26, Çakıldak- %40, Palaz-%40 ve Kalınkara- %36) belirlendi. Hücre sayımı, yaş ve kuru ağırlık ölçümleri yapılarak Kalınkara ve Tombul fındık çeşitlerine ait hücre süspansiyon kültürlerinin hücre üreme grafikleri oluşturuldu. Bu sonuçlara dayanılarak MeJa (100 μM) ve Phe (3 μM) elisitörlerinin uygulanması için hücrelerin logaritmik üreme fazının ortasında oldukları kültürlemenin 17. günü belirlendi. Hücre süspansiyon kültürlerinden üremenin durduğu kültürlemenin 30. günde toplam ve hücre dışına salınan taksanların ekstraksiyonu gerçekleştirildi. Elde edilen ekstraktlardan taksan türevi diterpen alkoloidlerden 10-deasetil bakkatin III, bakkatin III, sefalomannin ve paklitaksel moleküllerinin HPLC ile kalitatif ve kantitatif analizleri yapıldı. Tombul fındıkta toplam bulunan paklitaksel miktarının kontrol grubuna (3,81 ± 0,30 μg/g) göre 100 μM MeJa ve 3 μM Phe uygulanmış kültürlerde sırasıyla %42,5 (5,43 ± 0,31 μg/g) ve %56,1 (5,95 ± 0,17 μg/g) oranında arttığı belirlenmiştir. Benzer şekilde Tombul fındıkta hücre dışına salınan bakkatin III miktarı kontrol grubuna (19,65 ± 0,17 μg/g) göre 100 μM MeJa uygulanmış ve 3 μM Phe uygulanmış kültürlerde sırasıyla %43,6 (28,23 ± 1,54 μg/g), ve %78,3 (35,05 ± 0,74 μg/g) artmıştır. Yine Tombul fındıkta hücre dışına salınan sefalomannin miktarı kontrol grubuna (2,13 ± 0,03 μg/g) göre 100 μM MeJa uygulanmış ve 3 μM Phe uygulanmış kültürlerde sırasıyla %26,2 (2,69 ± 0,14 μg/g) ve %27,2 (2,71 ± 0,13 μg/g,) artmıştır. Kalınkara fındıkta ise hücre dışına salınan 10- DAP miktarı kontrol grubuna (41,71 ± 0,15 μg/g) göre 100 μM MeJa uygulanmış kültürde %9,8 (45,83 ± 1,49 μg/g) artış göstermiştir. Bu sonuçlara göre Tombul fındık antikanser taksan türevlerinin hücre süspansiyon kültürlerinde üretimi bakımından Kalınkara fındığa göre daha iyi sonuçlar vermiştir. Yapılan elisitasyon uygulamaları sonucunda Tombul fındıkta toplam paklitaksel, hücre dışına salgılanan bakkatin III ve sefalomannin üretimlerindeki artış oranlarının Kalınkara fındığa göre daha yüksek olduğu bulunmuştur. Bu tez çalışması ile Türkiye'de yetişen fındık çeşitlerinin ilk kez kallus ve sekonder metabolit üretimi amacıyla hücre süspansiyon kültürleri kurulmuştur. Bunun yanı sıra, yapılan elisitasyon çalışmaları sonucunda kemoterapinin ilk aşamasında yaygın olarak kullanılan Taxol® ilacının hammaddesi olan paklitaksel molekülünün Türkiye'de yetişen Tombul fındık (Corylus avellana) bitkilerine ait hücre kültürlerinde üretilebildiği gösterilmiştir. Yapılan elisitasyonlar ile hücre süspansiyon kültürleri kurulan fındık çeşitlerinde paklitaksel ve onun öncülleri olan diğer taksan türevi maddelerin üretimleri de arttırılmıştır. Bu tez çalışması, ülkemiz topraklarında yetişen fındık çeşitlerinin, paklitaksel ve paklitakselin kimyasal sentezinde kullanılan öncüllerden bakkatin III ve sefalomanninin üretiminde bir alternatif olarak değerlendirilebileceğini göstermektedir.