Bazı bitki ekstrelerinin in vitro antikanser ve apoptotik aktivitelerinin değerlendirilmesi

Bu tez çalışmasında, 3'ü Türkiye'ye endemik olan 7 metanolik bitki ekstresinin Vero [Afrika Yeşil Maymun (Cercopithecus aethiops) böbrek fibroblast hücre hattı], HeLa (insan serviks kanseri epitel hücre hattı), A549 (insan akciğer kanseri epitel hücre hattı), Mcf-7(insan meme kanseri epitel hücre hattı) ve PC-3 (insan prostat kanseri epitel hücre hattı) hücreleri üzerinde sitotoksik etkileri Mitokondriyal Dehidrogenaz Enzim Aktivitesi (MTT) Kolorimetrik Yöntemi ile belirlenmiştit. Potansiyel antikanser aktiviteye sahip olan Centaurea hermannii bitki ekstresinin ve kemoterapötik ajan olan Doxorubicin'in Vero ve HeLa hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkisini doğrulamak amacıyla xCELLigence RTCA DP sistemi ile hücre indeksi parametreleri belirlenmiştir. Daha sonra potansiyel antikanser aktiviteye sahip olan C. hermannii ekstreninin apoptotik aktivitesi biyokimyasal (Flow sitometri analizi), florometrik (Kaspaz 3,7 ve 9 aktivasyonu analizi) ve moleküler (qRT-PCR analizi) olarak değerlendirilmiştir. MTT analizi ile 48. saatte elde edilen veriler değerlendirildiğinde C. hermannii ekstresisinin sağlıklı hücre hattı Vero'daki düşük sitotoksisitesi ve serviks kanseri hücre hattı HeLa'daki seçici yüksek sitotoksisitesi potansiyel antikanser aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Kemoterapötik ajan olan Doxorubicin'in ve C. hermannii bitki ekstresinin sitotoksik etkileri Vero ve HeLa hücre hatları üzerinde denenerek elde edilen verilerle IC50 (Hücrelerin % 50'sinin ölümüne neden olan ekstre konsantrasyonu) ve SI (Seçicilik indeksi; SI= IC50 Vero hücresi / IC50 HeLa hücresi) değerleri hesaplanmıştır. C. hermannii bitki ekstresinin seçicilik indeksi ile Doxorubicin'in seçicilik indeksi değerleri karşılaştırılmıştır. IC50 değerleri Vero hücre hattında C. hermannii için 599 μg/mL ve Doxorubicin için 21,2 μM, HeLa hücre hattında C. hermannii için 15,74 μg/mL ve Doxorubicin için 8,4 μM olarak bulunmuştur. SI değerleri ise sırasıyla C. hermannii için 38,1, Doxorubicin için 2,5 olarak bulunmuştur. xCELLigence RTCA DP sistemi ile hücre indeksi parametlerinin analizi sonucunda IC50 değerleri Vero hücre hattında C. hermannii için 557,8 μg/mL ve Doxorubicin için 19,2 μM, HeLa hücre hattında C. hermannii için 18,3 μg/mL ve Doxorubicin için 7,8 μM olarak bulunmuştur. SI değerleri ise C. hermannii için 30,5 iken Doxorubicin için 2,5 olarak hesaplanmıştır. MTT analizinden elde edilen veriler hem morfolojik değerlendirmeler ile hem de xCELLigence sistemi ile yapılan analiz sonuçlarıyla tutarlı olarak bulunmuştur. Potansiyel antikanser aktiviteye sahip C. hermannii ekstresinin HeLa hücrelerindeki apoptotik aktivitesinin tayini 3 farklı yöntemle ortaya konulmuştur. Deneylerde Vero hücreleri için toksik olmayan fakat HeLa hücreleri için toksik olan (100 g/mL) ve HeLa hücreleri için yarı öldürücü olan (IC50=15,74 g/mL) iki konsantrasyon uygulanmıştır. C. hermannii ekstresinin uygulandığı apoptoza giden HeLa hücrelerinin sayısı FITC işaretli Annexin V ile flow sitometri analizi ile tespit edilmiştir. C. hermannii bitki ekstresinin 100 g/mL ve IC50 konsantrasyonları uygulanan HeLa hücrelerinin canlı, ölü ve geç apoptotik popülasyonları kontrol grubuna göre anlamlı olup bu bitki ekstresinin HeLa hücrelerinde apoptotik etkiye sahip olduğu ortaya konulmuştur. Elde edilen sonuçlar sitotoksisite sonuçları ile uyumlu bulunmuştur. C. hermannii ekstresinin HeLa hücrelerindeki antikanser aktivitesinin apoptoz ölüm yolu ile gerçekleştiği flow sitometri analizi ile belirlendikten sonra apoptotik aktivitenin belirlenmesi için önemli bir diğer yöntem olan kaspaz aktivitesi tayini ile C. hermannii ekstresinin HeLa hücrelerindeki kaspaz 3,7 ve 9'un aktivasyonuna etkisi belirlenmiştir. C. hermannii ekstresinin HeLa hücrelerindeki apoptotik kaskadın başrol oyuncuları olan yürütücü kaspazlardan kaspaz 3,7 ve başlatıcı kaspazlardan kaspaz 9'un aktivasyonunu arttırdığı spektroflorometrik olarak belirlenmiştir. Son olarak, C. hermannii ekstresinin uygulandığı HeLa hücrelerinde apoptoz, nekroz ve otofajiye özgü genlerin anlatım seviyeleri qRT-PCR analizi belirlenmiştir. qRT-PCR analizi sonucunda elde edilen verilere göre apoptotik genlerden FAS, HRK ve TNFRSF10B genleri C. hermannii bitki ekstresinin her iki konsantrasyonda da HeLa hücrelerinde yukarı regüle olmuştur. Nekrotik genlerden RIPK, HeLa hücrelerinde C. hermannii bitki ekstresinin oldukça toksik olan 100 µg/mL konsantrasyonunda aşırı yukarı regüle edilmiştir. RIPK, C. hermannii bitki ekstresinin IC50 konsantrasyonunda da yukarı regüle edilmiştir. Otofajik genlerden BECN, C. hermannii bitki ekstresinin her iki konsantrasyonda da HeLa hücrelerinde yukarı regüle olmuş, ATG3 ve ATG5 genleri ise sadece C. hermannii bitki ekstresinin 100 µg/mL konsantrasyonunda yukarı regüle edilmiştirler. Bu sonuçlar, C. hermannii ekstresinin serviks kanseri tedavisi için potansiyel olarak aktif yeni bir ilacı temsil edebileceğini ve umut veren sitotoksik ve apoptotik aktivitesi nedeniyle daha fazla çalışmayı destekleyebileceğini düşündürmektedir.