Botulinum nörotoksin serotip a inhibitörlerinin ubikitin-proteazom sistem inhibitör kütüphanesinin taranmasıyla belirlenmesi

Botulinum nörotoksini (BoNT) ölümcül olan botulizm hastalığına sebep olan, bilinen en güçlü bakteriyel toksindir. Yüksek toksisiteye sahip olması ve kolayca üretilebiliyor olması sebebi ile bu toksin birçok ülke tarafından kategori A biyolojik ajanlar sınıfında değerlendirilmektedir. Aynı zamanda, kozmetik amaçlı olarak kırışıklıklardan kurtulmak için kullanılmasının yanı sıra, hareket bozukluklarının da içinde olduğu birçok hastalığın tedavisinde klinik alanda uygun doz ve uygulama ile yaygın olarak kullanılmaktadır. BoNT spesifik olarak kolinerjik sinir terminallerini hedef alır ve nöroeksositoz için kritik öneme sahip olan SNARE kompleks proteinleri keserek asetilkolin salınımını bloke eder. Botulinum nörotoksininin serolojik olarak farklı 8 farklı serotipi vardır (BoNT/A–G, BoNT/X) ancak yalnızca A, B, E ve F serotipleri insanda botulizme neden olur. Bu serotipler arasında, BoNT/A klinik alanda en yaygın kullanılan serotiptir, ayrıca botulizm vakalarının yarısından fazlası BoNT/A zehirlenmesine bağlı olduğu için üzerinde en fazla çalışma yapılan serotiptir. Serotip A, diğer serotiplere kıyasla en uzun ömüre sahiptir. Örnek olarak, Serotip A ve E, aynı proteini (SNAP-25) kesmelerine karşın, BoNT/E hücre içinde bir kaç günlük yarılanma ömrüyle kısıtlıyken BoNT/A sitoplazmada 6 ay kadar aktif bir halde kalabilir. Yarılanma ömürleri arasındaki bu farkların altında yatan moleküler mekanizmalar henüz tam anlamıyla açığa çıkarılmamıştır. Buna karşın BoNT/A'nın nöronlardaki yıkıcı protein bozunma mekanizmasından nasıl kaçtığını anlamaya yönelik araştırma ilgisi artmıştır. Son çalışmalar E3 ligaz ve deubikitasyon enzimlerinin BoNT/A yıkımı için kritik önem arz ettiklerini ortaya çıkartmıştır. Spesifik olarak HECTD2 adındaki E3 ligaz BoNT/A hafif zincirinin ubikitasyonuna sebep olmaktadır ancak bu proteolitik degradasyon VCIP135 isimli deubikitasyon enziminin yoğun aktivitesiyle inhibe edilmektedir. Ayrıca USP9X isimli deubikitasyon enzimi indirekt olarak hücre içindeki BoNT/A stabilitesini etkilemektedir. Bu sebeple, Serotip A'nın hücre içindeki aktivitesinin sürekliliği spesifik düzenleyici faktörler kullanılarak modifiye edilebilir. BoNT/A'nın yıkımını düzenleyen küçük ilaç moleküllerinin geliştirilip tanımlanması, bu serotipe karşın etkili önemler geliştirmesi için önem arz etmektedir. Bu sebeple, bu tez çalışmasında ubikitin-proteozom sistemini hedef alan küçük molekül kütüphanelerinin taranması ile BoNT/A intoksitesi üzerinde etkili olan moleküllerin belirlenmesi ve toksinin katalitik olarak aktif kısımı olan hafif zinciri üzerindeki etkilerinin araştırılması hedeflenmektedir. Fare embriyonik kök hücreleri kullanılarak yapılan tarama sonucunda, BoNT/A aracılığı ile SNAP-25 kesilmesine karşı nöronlarda etkinliği olan öncü on adet potansiyel bileşik belirlenmiştir. Daha sonra, bu öncü bileşiklerin doza bağlı etkileri ve hücrelerdeki potansiyel toksik etkileri test edilmiştir. Bir sonraki aşamada öncü bileşiklerin hücre içerisindeki LC stabilitesi üzerindeki etkileri incelenmiştir. WP1130, b-AP15, NSC632839, PR-619, Celastrol, MDBN, PYR-41 ve SL-01 adlı küçük moleküller, BoNT/A LC etkilerine ve yarılanma ömrüne karşı etkili sonuç verdiler. Bunlar arasında, PR-619 adlı bileşik, BoNT/A LC'nin yarı ömrünü etkileyen çok önemli bir DUB olarak tanımlanan bir VCIP135 inhibitörü olduğu için oldukça önemli görünmektedir. Bu çalışma, hücrelerdeki küçük moleküllerin mekanik etkisini gösteren literatürdeki bilgimiz dahilinde olan ilk çalışmadır, bu sebeple farklı BoNT serotipleri arasındaki stabilite farklarının sebeplerinin ortaya çıkartılması için önem arz etmektedir.