The regulation of the CXXC5 gene expression

Vücutta dolaşımda bulunan ana östojen hormonu 17β-estradiol (E2)'dur ve başta meme dokusu fonksiyonları olmak üzere, farklı dokuların fizyolojik ya da patofizyolojik durumlardaki düzenlenmesinde görev alır. E2 hedef dokularındaki, hücresel çoğalma, farklılaşma ve/veya ölüm görevlerinden sorumludur. Önceki mikrodizin çalışmalarımız, CXXC5 ifadesinin E2-ERα ile düzenlendiğini ve bunun ERE-bağımlı sinyal yolağı üzerinden gerçekleştiğini önermekteydi ve biz de CXXC5 transkript seviyelerinin E2'ye yanıtla arttığını doğruladık. CXXC5 bir ZF-CXXC5 domain protein ailesi üyesi olarak yüksekçe korunmuş olan CXXC domaini ve nükleer lokalizasyon sinyali içermektedir. Fonksiyonel olarak karakterize edilmiş olan ZF-CXXC protein ailesi üyeleri, CXXC domainleri aracılığyla; tercihen transkripsiyonel olarak aktif olan DNA bölgelerindeki CpG adalarının, metile-olmamış CpG dinükleotitlerine bağlanmaktadırlar; biz de CXXC5'in de metile-olmamış CpG dinükleotitlere bağlanan bir protein olduğunu gösterdik. Bu bağlanma sayesinde sitozin metilasyonu engellenerek, tranksripsiyon düzenlenmesinde görev alan histon modifiye edici proteinlerin getirilmesi için, doğrudan ya da dolaylı olarak kullanılan bir çekirdeklenme alanı oluşturulur. CXXC5 ile ilgili yapılmış olan kısıtlı çalışmaya göre CXXC5; farklı sinyallere yanıtla, epigenetik düzenleyici ve/veya eş-düzenleyici olarak görev almaktadır. Ancak CXXC5 geninin ekspresyonunun nasıl sağlandığı ile ilgili mekanizmalar hala bilinmemektedir. Doktora çalışmalarımda, CXXC5 proteininin sentezlenmesinin tıpkı CXXC5 ifadesinde olduğu gibi E2-yanıtlı ve ERα bağımlı olduğunu gösterdim. CXXC5 lokusunda yer alan bir de novo ERE buldum ve ERα'nın hem in vitro hem de in cellula olarak bu ERE'ye bağlandığını gösterdim. Buna ek olarak, reportör enzim tahlilleri kullanarak, E2-ERα kompleksinin bu ERE'ye bağlanmasının fonksiyonel olduğunu ve trankripsiyonel bir aktivasyon sağladığını bulguladım. Sonrasında bu distal olarak konumlanmış olan ERE'nin CXXC5 ifadesinin düzenlenmesine nasıl katkıda bulunduğunu anlayabilmek için CXXC5 promotörünü bulgulamak üzere çalışmalarıma devam ettim. CXXC5'in tanımlanmış olan 14 transkript varyantı olduğundan, model hücre hattımız olan MCF7'lerde hangi CXXC5 varyant(lar)ının daha çok bulunduğunun tespit edilmesinin CXXC5 promoter çalışmaları için gerekli olduğuna karar verdim. Bu sebeple ana CXXC5 varyatını (CXXC5-TV2) tespit ettikten sonra, öz promotör elemanları genellikle transkripsiyon başlangıç noktaları (TSSs) civarında yer almakta olduğu için; bu varyanta yönelik olarak 5'Rapid Amplification of cDNA Ends (5'RACE, cDNA sonlarının hızlı olarak çoğaltılması) yaklaşımını kullanarak transkripsiyon başlangıç noktalarını belirledim. Sonrasında lusiferaz raportör tahlilleri kullanarak CXXC5 öz promotör elemanlarının yerini saptadım. CXXC5 promotörünün CXXC5-TV2'nin ilk eksonu içinde yer aldığını ve CXXC5'in bir CGI promotör (CpG Island Promoter, CpG Adacık Promotör) tarafından düzenlendiğini bulguladım. Promotör bölgesini tespit ettikten sonra, CXXC5 promotörü ile etkileşime geçen proteinleri tespit edebilmek amacıyla promotör çöktürme çalışmaları gerçekleştirdim. Sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile tespit edilen proteinlerden, ELF1 (E74 Like ETS Transcription Factor 1), MAZ (Myc-associated zinc finger protein), and RB1 (Retinoblastoma-associated protein) proteinlerinin CXXC5 promotörüne in vitro ve in cellula olarak bağlandığını gösterdim. Ayrıca CXXC5 promotörü içerisinde; ELF1 ve MAZ transkripsiyon faktörlerinin bağlanma motif sekanslarının yerini tespit ettim. Buna ek olarak, ELF1 ve MAZ proteinlerinin CXXC5 ekspresyonunun düzenlenmesine dahil olduklarını arttırma (overexpression) ve azaltma (knocking-down) çalışmaları ile gösterdim. CXXC5 ekspresyonunun ve buna bağlı olarak protein sentezinin, E2-ERα sinyali tarafından, intronik bir bölgede yer alan ERE üzerinden düzenlendiğini gösterdim. CXXC5 promotör bölgesini bulguladım ve promotör ile etkileşime geçen birkaç transkripsiyon faktörünü göstererek, bunların CXXC5 ifadesinin düzenlenmesine dahil olduklarını tespit ettim. Tezimde gösterdiğim bulgular, E2-yanıtlı olan CXXC5 geninin nasıl düzenlendiğinin anlaşılabilmesi için bir temel oluşturacaktır. Buna bağlı olarak da E2-ER sinyal yolağının fizyolojik ve patofizyolojik koşullardaki aksiyonlarının daha iyi anlaşılmasını sağlayabilecektir.