Lokusa özgü transkripsiyonel faktörlerin keşfi için yeni metotların geliştirilmesi ve uygulanması

Kromatin ile ilişkili faktörler gen regülasyonunda önemli rol oynarlar. Bu faktörlerin tanımlanması, hedef DNA sekanslarındaki fonksiyonel rollerinin aydınlatılması için önemlidir. Bu kromatin regülatörlerini lokus-spesifik şekilde tanımlamak için belirli birkaç metodoloji vardır, fakat bu metotların bir sürü dezavantajları ve kısıtlamaları bulunmaktadır. Biz bu çalışmada, lokus-spesifik transkripsiyonel regülatörleri keşfedebilmek için, CRISPR proteinlerinin esnek hedeflenebilirliği ile in vivo olarak kullanacağımız biotinilasyonu birleştirerek Split-CRISPR-ID olarak adlandırdığımız yeni bir metot geliştirmeyi hedefledik. Bu sistemi seçici olmayan mutant BirA* biotin enziminin inaktif iki parçasını iki farklı CRISPR proteini ile birleştirerek kurduk. Öncelikle, CRISPR proteinlerinin bağlanma yeterliliklerini çeşitli gen bölgelerinde doğruladık. Sonrasında, amaçladığımız spesifik gen lokusunda in vivo biotinilasyonu zamansal ve konumsal açılardan kontrol etmemizi sağlayacak olan füzyon proteinlerimizi oluşturduk. İlk sonuçlarımız BirA* enziminin test ettiğimiz gen lokuslarında birleştiğini ve aktive olduğunu gösteriyor. Bunun yanında, yakın zamanda yayınlanmış olan CAPTURE metodunu optimize etmeyi amaçladık. Bu method ile spesifik gen lokuslarını güçlü biotin-streptavidin etkileşimi sayesinde izole ettik. Bu bölgelerdeki lokus-spesifik proteinleri western blot yöntemiyle gözlemledik. Tez kapsamında çalıştığımız bu metotların yeni lokus-spesifik transkripsiyonel regülatörlerin keşfedilmesinde ve bunlara yönelik terapiler geliştirilmesinde yardımcı olacağını düşünüyoruz.