ASP50 aminoasidinin protein sentezi elongasy-on faktörü Tu'nun işlevindeki rolü

Elongasyon faktörü EF-Tu, protein sentezi sırasında aminoasil-tRNA?yı ribozoma taşımakla sorumlu temel enzimdir. EF-Tu, GTP ile bağlandığı etkin formunda, EF-Tu ? GTP ? aminoasil-tRNA şeklinde üçlü bir bileşik oluştururken, GDP bağlı formunda etkisizleşmiştir. EF-Tu?nun GTP ve GDP bağlı halleri arasındaki yapısal geçiş sırasında, nükleotid bağlanan bölgesinde çok hareketli ve kararsız bir yapıda bulunan Switch I alt bölgesi, şeklini ?-sheet?den ?-helix?e çevirir. Bu tez çalışmasında, Escherichia coli EF-Tu?sunda Switch I bölgesinde bulunan Asp50 aminoasidinin rolü çalışılmıştır. Bu amaçla EF-Tu üzerinde 50. pozisyonda bulunan aspartik asit yerine alanin ve asparajin mutantları yaratılıp bu EF-Tu mutantlarının, GDP, GTP ve aminoasil-tRNA ile ilişkilerinin yanısıra poli(Phe) sentezi, GTP hidrolizi ve dipeptid oluşumundaki aktiviteleri de in vitro kinetik deneylerle incelenmiştir. EF-Tu?nun D50A ve D50N mutantları, GDP bağlaması ve GDP/GTP nükleotid değişim hızları açısından doğal EF-Tu'ya benzemektedir. Ancak, Asp50 mutantlarının aminoasil-tRNA ile bağlanmalarında ciddi bir azalma gözlemlenmiştir. Çok yüksek miktarlarda aminoasil-tRNA varlığında incelendiğinde, Asp50 mutantları poli(Phe) sentezini doğal EF-Tu ile karşılaştırılabilinir ölçülerde yerine getirebilmiştir. Öte yandan, GTP hidrolizi ve dipeptid oluşumu açısından incelendiklerinde, GTP hidrolizleme hızları fark göstermemekle birlikte, EF-Tu mutantlarının hidrolizleyebildiği toplam GTP miktarlarının doğal EF-Tu?ya nazaran önemli oranda düşmüş olduğu gözlemlenmiştir. Bu tez çalışmasının sonuçları doğrultusunda Asp50 aminoasidinin kararlı bir EF-Tu.GTP yapısının sağlanması için mutlak gerekliliği olduğu öngörül-müştür. Asp50 aminoasidi mutasyona uğratıldığında, enzimin GDP konformasy-onununa geçişinin kolaylaştığı, böylece mutantların aminoasil-tRNA ile bağlan-abilmesinin neden zorlaştığı da anlaşılabilmektedir. Öte yandan Asp50 mutantları ile oluşan EF-Tu ? GTP ? aminoasil-tRNA bileşikleri ribozomun A bölgesine ulaştığında, mutant EF-Tu?ların bazıları GDP yapılarına geri dönebilir, dolayısıyla GTP hidrolizine gerek kalmadan aminoasil-tRNA'yı bırakabilir ve serbest kalan aminoasil-tRNA dipeptid oluşumuna olanak sağlıyor olabilir.