Akut solunum yolu enfeksiyonlarında rhinovirusların genotiplendirilmesi

Giriş: Rhinovirus (RV) tüm dünyada akut solunum yolu enfeksiyonlarında en sık belirlenen patojendir (1). Virüsün her yıl tüm dünyada akut solunum yolu enfeksiyonlarının yaklaşık % 50'sinden sorumlu olduğu bildirilmiştir. Genellikle hafif üst solunum yolu enfeksiyonu ve soğuk algınlığına sebep olur. Ancak, astım, kistik fibrozis ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) hastalarında alevlenme, pnömoni, sinüzit, otit ve özellikle küçük çocuklarda wheezing (hışıltı) ile ilişkisi bilinmektedir. Rhinoviruslar moleküler yöntemler ile RV-A, RV-B ve RV-C olarak üç tür altında tanımlanmışlardır. Yapılan çalışmalarda ise RV-A ve RV-C'nin daha çok alt solunum yolu enfeksiyonu ve astım alevlenmeleri ile ilişkili olduğu, RV-B'nin ise bu türlere göre alt solunum yolu enfeksiyonlarında daha az oranda görüldüğü gösterilmiştir. Rhinovirus-C'nin özellikle çocuk hastalarda daha şiddetli enfeksiyonlara neden olduğu da belirlenmiştir. Bu çalışmanın amacı, solunum yolu enfeksiyonu olan hastalardan alınan nazofaringeal örnekler içinde RV pozitif olarak saptanmış olanların dizi analizi yöntemi kullanılarak RV türlerinin belirlenmesidir. Ayrıca belirlenen türler ile hastaların klinik tanı, viral yük, yaş ve cinsiyetleri arasında bir ilişki olup olmadığının gösterilmesidir. Gereç-Yöntem: Çalışma grubu, Ocak 2014-Ocak 2016 tarihleri arasında Adnan Menderes Üniversitesi Hastanesine akut solunum yolu şikayetleri ile başvurmuş ve daha önce iki farklı ticari mültipleks gerçek zamanlı PZR kiti ile(FTD Respiratory pathogens 21 (Fast-track diagnostics Ltd., Malta) ve Anyplex™ II RV16 Detection V1.1 (Seegene Inc., Seoul, Korea)) RV pozitifliği belirlenmiş olan 46 erişkin ve 50 çocuk olmak üzere toplam 96 hastadan oluşmaktadır. RV Pozitif örneklerin viral yükleri kantitatif gerçek zamanlı PZR kiti (LightCycler® 480 RNA Master Hydrolysis Probes, USA) ile belirlendi. Kantitatif gerçek zamanlı PZR sonrasında elde edilen ürünlerdeki bantları göstermek için, FastStart High Fidelity PCR System, dNTPack kiti kullanılarak konvansiyonel PZR yöntemi uygulandı. Saflaştırılan PZR ürünlerine BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit kullanılarak dizi analizi-döngü PZR uygulandı. PZR ürünleri tekrar saflaştırılarak ABI Prism 3100/3100 cihazına yüklendi çift yönlü dizi analizi gerçekleştirildi. Elde edilen diziler National Center of Biotechnology Information 'ın web sayfasındaki (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) Nucleotide BLAST programı kullanılarak karşılaştırıldı. Çalışmada elde edilen veriler SPSS 17.0 (Inc, Chicago, IL, USA) paket programı ile değerlendirildi. Analitik analizlerde ki-kare testi kullanıldı. Filogenetik analizler Geneious 9.1.3 programı kullanılarak yapıldı. Analizlerde rhinovirusun VP4/VP2 kapsit kodlayan bölgesinin yaklaşık 400 bp uzunluğundaki kısmı kullanıldı. Türler, filogenetik ağaç ve VP4/VP2 proteini kodlayan referans dizilerin neighbour-joining metodu ile değerlendirilmesi ile belirlendi. Referans sekanslar GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) dan indirildi. Test parametreleri minimum identifikasyon %70, Bootstrap değeri 1000 tekrar olarak ayarlandı. Referanslar ile aynı kümede (cluster) toplanan izolatların türleri belirlendi. Bulgular: Çalışmaya dahil edilen çocuk hastaların yaşları 22 gün-16 yaş arasında değişmekte olup yaş ortalaması 24 ay (6,19-72), erişkin yaş grubundaki hastalarda ise yaş aralığı 18-86 yaş olup, yaş ortalaması 57,63±15,68 olarak belirlendi. İki ticari multipleks gerçek zamanlı PZR testi ile RV pozitifliği saptanan 127 örneğe uygulanan kantitatif gerçek zamanlı PZR sonucunda, viral yükleri belirlenemeyen 31 örnek çalışmadan çıkarıldı. Viral yükleri belirlenen 96 örneğe uygulanan konvansiyonel PZR sonucunda 32 erişkin, 33 çocuk olmak üzere toplam 65 örnekte beklenen boyutlarda bant görüldü. Dizi analizine alınan 65 örnekte 28 (%43,07) RV-A, 7 (%10,76) RV-B ve 28 (% 43,07) RV-C ; birer örnekte ise EV-D68 (%1,53) ve EV-C (%1,53) belirlendi. Erişkin hastalarda tür dağılımı 15 (%48,3) RV-A, 5 (%16,1) RV-B, 11 (%35,4) RV-C; Çocuk hastalardaki dağılım ise ise 13 (%40,6) RV-A, 2 (%6,3) RV-B ve 17 (%53,1) RV-C olarak bulundu. Hem çocuk hem erişkin hastalarda belirlenen RV türleri ve hastaların klinik tanıları, viral yükleri, yaş ve cinsiyet verileri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmamıştır (p> 0,05). Sonuç: Çalışmamızda tüm hasta grubunda RV-A ve RV-C eşit oranda, RV-B daha az oranda saptanmıştır. Çocuk hastalarda RV-C, erişkinlerde ise RV-A en sık tür olarak belirlenmiştir. Hem erişkin hem de çocuk hasta gruplarında, belirlenen RV türleri ve hastaların klinik tanıları, viral yükleri, yaş ve cinsiyet verileri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmamıştır. Bu çalışma ile ülkemizde ilk defa RV türlerinin epidemiyolojisi ortaya konmaya çalışılmıştır. Elde edilen veriler, RV enfeksiyonlarının epidemiyolojisi ve patogenezinin daha iyi anlaşılmasını sağlayabilecektir. Klinik tanı ve RV türleri arasındaki ilişkinin gösterilebilmesi için daha geniş hasta popülasyonları ile yapılacak çalışmalara ihtiyaç vardır.