Systematic evolution of novel 2′F-PY RNA aptamers targeting the membrane protein l-arginine/agmatine antiporter purified in mild detergent

Bakteriyel mikroorganizmalar, dış ortamlarındaki potansiyel olarak zararlı asidik koşulların üstesinden gelebilmek için çok sayıda ve çeşitli sistemler geliştirmiştir. Özellikle, bazı patojenik ve diğer patojenik olmayan enterik bakteriler, hücre içi asidifikasyona ve memeli midesinin aşırı asidik koşulları altında hayatta kalmayı mümkün kılan hasara karşı koyabilmek için birlikte çalışan bir dizi istisnai ve iyi organize edilmiş asit direnci (AR) mekanizmasına sahiptir. Hem virülan hem de iyi huylu suşları ile ortak Escherichia coli, nötr pH'a adaptasyonu göz önüne alındığında özellikle dikkat çekicidir. Bu bakterilerde, düşük dış pH baskısı, bir sitoplazmik pirodoksal-5′-fosfat (PLP) bağımlı amino asit dekarboksilaz ve bir iç plazma membran amino asidi antiporter jenerik bileşenden oluşan oldukça güçlü proton tüketimli AR sistemleri aracılığıyla etkili bir şekilde hafifletilir. Bir substrat amino asidinin dekarboksilasyonu sonrasında bir ürüne ve CO2'ye dönüştürülmesi protona bağımlı PLP katalizli bir şekilde elde edilir. Daha sonra, dahili olarak üretilen dekarboksilasyon ürününün hem antiporter aracılı değişimi hem de harici olarak yerleştirilmiş substrat amino asidi, sistemin çalışmasını sağlar ve hücrenin pH homeostazının geri kazanılmasına yardımcı olur. Bu sistemlerden biri, AdiA ve AdiC tarafından oluşturulan arginin bağımlı asit direnci (ADAR) sistemidir: sırasıyla indüklenebilir arginin dekarboksilaz enzimi ve arginin / agmatin antiportörü. AR sistemlerinin etkileyici yeterliliği ve özellikle bulaşıcı, hastalığa neden olan enterik bakteriler tarafından kullanılanlar, büyük bir maliyete- insanların refahına ve sağlığına – sebep olmaktadır. Bundan böyle, bu çalışmada, ve ilk kez, ADAR sisteminin integral membran proteini (MP) AdiC'ye karşı beş 2'FY RNA aday aptamerini (noorA, noorB, noorC, AdiC19 ve AdiC72) seçilimini gerçekleştirdik. Kısaca, AdiC, BL21 (DE3) pLysS hücre hattında uygun prokaryotik ekspresyon sistemi kullanılarak rekombinant olarak eksprese edildi ve his-etiketli AdiC, daha sonra n-dodesil-β-D-maltopiranosid (DDM) kullanılarak çözündürme yoluyla ekstrakte edildi ve aynı deterjanda metal afinite kromatografisiyle saflaştırıldı. SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ile varlığı onaylandıktan sonra, saf rekombinant AdiC, 2'F-Pirimidin ile modifiye edilmiş aday RNA aptamerlerinin in vitro seçimi için Eksponansiyel zenginleştirme (SELEX) ile 8 tur geleneksel Ligandların Sistematik Evrimine tabi tutuldu. Son olarak elde edilen seçim kütüphanesinden oligonükleotid sekansları klonlandı ve Sanger sekanslaması ile sekansları belirlendi. Üç dizi (noorA noorB ve noorC) 100 klon arasında bol miktarda bulundu ve bu nedenle sonraki bilişim analizleri için temel olarak seçildi. RNAfold ve Kinefold programları tarafından tahmin edilen birincil ve optimal (MFE) 2D ikincil yapıların karşılaştırmalı analizleri ile hesaplamalı bir yaklaşım kullanarak, üç korunmuş motifi belirleyebildik (bunlardan biri varsayılan yerel bağlanma alanı ve diğer ikisi de stabilizatör olarak açıklandı). Bu motifler noorA, B ve C'de ve farklı bir filogenetik ailede iki tane daha tanımlanmış dizide (AdiC19 ve AdiC72) belirlendi. Ayrıca, bu beş proto-aptamerin uyduğu bir konsensüs ikincil yapı tanımladık. Stabilizatör motiflerinin sonraki tahmin odaklı (in-siliko) mutasyonel delesyonları, varsayılan bağlanma motifini barındıran alt yapının korunması üzerindeki tahmini MFE yapılarının birçoğunda küresel etkilerini ortaya çıkardı. Bu çalışmada elde edilen beş aptamer adayı, hastalardaki bakteriyel enfeksiyonları değerlendirmek için (örneğin aptasensörler tarafından) veya antimikrobiyal farmasötik ilaçlar veya ilaç verme ajanları olarak kullanılabilecekleri aptamer bazlı teşhis ve tedavi alanlarında uygulama için çok yönlü ajanlar olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Temel bilimsel araştırma düzeyinde, bu aptamerler, AdiC'nin yapısal özelliklerini ve biyokimyasal işlevlerini daha iyi anlamak için de yararlı olabilir. Daha genel olarak, son 20 yılda saflaştırılmış tam uzunluktaki proteinlere karşı SELEX denemelerinin azlığı göz önüne alındığında, bu tez kendini, saflaştırılmış tam uzunluktaki aptamerlerin kullanılabilirliğine dikkat çeken ilk çalışmalardan biri olarak sunulmaktadır. Bu yöntem, geleneksel protein-SELEX'in hücre-SELEX'e göre sağladığı avantajlarla ve çözülebilir hücre içi ve hücre dışı MP alanlarının hedef olarak kullanımıyla uyumludur. Bu tezin sonunda, çok geçişli veya derin entegrasyon ve membranlar içindeki yakınlık nedeniyle aptamer hedeflemesi için genellikle erişilemeyen reseptörler, taşıyıcılar ve kanallar gibi karmaşık MP'ler için mevcut özel bir fırsat sunmaktadır.