Aptamer selection against cadaverine/lysine antiporter (CADB) purified in mild detergent

Membran Proteinlerinin (MP) hedef molekülü olarak kullanımı, sahip oldukları amfipatik doğaları nedeniyle zordur. MP'lerin çift katlı lipit tabakasında bulunan hidrofilik ve hidrofobik kısımları, MP'lere karakteristik işlevlerini kazandırır. Bu sebeple, in vitro çalışmalarda, MP'lerin doğru bir şekilde işlevlerini yerine getirebilmeleri için protein katlanmasını sağlamak adına doğal çevrelerini taklit edebilecek bir ortama gereksinim duyulmaktadır. Bu noktada, deterjan ile muamele MP'lerinin işlevlerini yitirmeden çözünmesi ve stabil bir protein olarak kalması açısından çok önemlidir. Biz çalışmalarımızda, aptamer seçilimi için, Escherichia Coli'nin iç membranında yer alıp, ikincil bir antiport olan ve aynı zamanda asidik stres adaptasyonunda önemli rol oynayan Kadaverin/Lösin Antiportu (CadB) proteinini MP'lerine bir model olarak hedefledik. Aptamerler, in vitro olarak seçilen DNA ya da RNA oligonükleotitlerinden oluşan kısa nükleik asit zincirleridir. Aptamerlerin seçilimi, Üstel Zenginleştirme ile Ligandların Sistematik Evrimi (SELEX) yöntemi ile gerçekleştirilir. Bu süreç, yüksek afinite ve seçilimle hedef molekülüne bağlanan aptamer/leri seçmek için tekrarlayan turlarla oluşmakta olup üç ana adımda bir tur tamamlanmaktadır: hedef molekülü ile inkübasyon, oligo-bağlı protein yapılarının ayrılması, oligo çoğaltma. Hedef molekülü ile etkileşim, aptamerin yapısında konformasyonel bir değişiklik meydana getirir. Aptamer geliştirildikten sonra, bu etkileşim, ileriki çalışmalarda tedavi ve teşhis alanlarında potansiyel kullanıma sahiptir. Şimdiye dek, aptamer seçiliminde pek çok SELEX tekniği kullanılmıştır. Fakat bunlardan bazıları iş gücü gerektiren, zaman alıcı ve MP'lere karşı özgüllüğü düşük olan yöntemlerdir. Bu projede, seçilimi gerçekleştirmeden önce, CadB'nin çözünürlüğünü ve saflaştırılmasını hafif bir deterjan olan n-dodesil-β-D-maltopiranosit (DDM)'te gerçekleştirdik. Son tur tamamlandıktan sonra, RNA havuzu sekanslaması yapıldı ve son olarak 29 farklı sekans elde ettik. En çok tekrarlanan sekansları (iki kez tekrarlanmış şekilde) belirledik: CadB30, CadB35 ve CadB39. Sonrasında, çoklu sekans hizalama analizi ile potansiyel bağlanma motifini bulduk. Sonra, tahmini ikincil yapılara (RNAfold ve KineFold tarafından yapıldı) göre, bu motif CadB35 ve CadB39'un ilmik (loop) yapısında bulunurken, CadB30'un sap (stem) yapısında bulundu. Ayrıca, biz bunların yapısal benzerliklerini homoloji matriksleriyle göstermek için, CadB30 ve CadB39'a yakın olacak şekilde rastgele bir proto-aptamer (CadB41) seçtik. Biz bu çalışmada, sekiz tur protein-SELEX'inden sonra CadB'ye karşı aptamerleri başarıyla elde ettik. Bu çalışma, CadB bir MP olarak, uygun bir deterjanda protein-SELEX ile hedef molekülü olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu şekilde, yakın gelecekte teşhis ve tedavi amaçlarında, MP'lerin hedef molekülü olarak kullanımı daha elverişli hale gelecektir. Protein-SELEX, bütün proteinler için uygun olduğundan daha basit, zaman kazandıran, uygun maliyetli aptamer seçilimi sağlar.