HPLC ile proteinlerin ayrılmasında dedeksiyon amaçlı yeni on-line yöntemin geliştirilmesi ve gıda ve ilaç analizinde uygulanması

Protein tayininde kullanılan mevcut UV-Vis spektrofotometrik yöntemlerin taraması yapıldıktan sonra, bu yöntemlerden üstün validasyon özelliklerine sahip olanların HPLC ile protein ayrılmasına uyarlanması sayesinde kolon sonrası reaktif enjeksiyonuyla kantitatif protein tayininin yapılabileceği on-line HPLC-Protein tayin sistemi (On-line HPLC-Biüret, On-line HPLC-Ninhidrin, On-line HPLC-Bradford) geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu yöntemlerden dedeksiyon açısından üstün olan On-line HPLC-Bradford yöntemi ile ayırım sonrası 595 nm'de kantitatif miktar belirleme mümkün olmuş, 280 nm'deki yarı kantitatif ölçüme göre daha güvenilir ölçümlere imkan sağlanmıştır. Bilinen çeşitli standart protein numunelerinin (CA ve BSA proteinleri) kullanılmasıyla on-line yöntemin optimize edilmesinden sonra tayin ve tespit sınırları belirlendi ve gıda (jelatin proteini) ve biyofarmasötik ilaç (insülin, immünglobulin G proteinleri) proteinlerinin boyut dışarılama kolonu ile kantitatif tayini gerçekleştirilmiştir. Ayrıca organik çözücü sistemlerinin (metanol, etanol, asetonitril) proteinler (CA, BSA, immünglobulin G, insülin) ve Bradford reaktifi ile birlikte on-line HPLC'de izokratik ya da gradient uygulamaları farklı kolon sistemleri için model teşkil etmesi amacıyla % kompozisyonları değiştirilerek spektrofotometrik analizleri yapılmıştır. 0.3 mL/dk akış hızı, 70 mg/L reaktif konsantrasyonu, 30 °C sıcaklık ve 2.5 m tubing uzunluğu optimum olarak belirlenmiştir. Ayrıca son karışımda suyun yanında % 10'a kadar organik çözücünün de kullanılabileceği gösterilmiştir.