MiRNA based identification of prostate cancer by investigation of urinary exosomes

Prostat kanseri, görülme sıklığı ve ölüm oranı en yüksek olan kanser tiplerinden biridir. Günümüzde prostat kanseri teşhisi, rektal muayene, Prostat Spesifik Antijen (PSA) testi ve biyopsiye dayanmaktadır. Normal PSA aralığı 0-4 ng / ml olarak tanımlanır ve bundan daha yüksek PSA seviyeleri olan kişiler potansiyel prostat kanseri hastaları olarak kabul edilir. Ancak PSA seviyesi birçok faktörün bir sonucu olarak değişkenlik gösterebilir ve yaşla birlikte arttığı gösterilmiştir. Bu nedenle, PSA testi, önemli ölçüde yanlış pozitif sonuçlara neden olur ve birçok sağlıklı erkek, yüksek PSA seviyeleri nedeniyle gerekmediği halde biyopsi yaptırır ve hatta tedavi görür. Bu durumun bu insanlar üzerinde çok büyük psikolojik etkilerinin yanı sıra finansal etkileri de vardır. Biz bu çalışmada, prostat kanserinde üriner eksozomal mikroRNA'ların (miRNA) tanısal potansiyelini araştırdık. Hücresel miRNA'ları araştırmak yerine, eksozomların yüksek bütünlüğü ve idrar dâhil birçok biyolojik sıvı içerisindeki bolluğu nedeniyle eksozomal miRNA'lara odaklandık. İdrardan hassas bir teşhis yönteminin geliştirilmesinin avantajlarından biri prostat kanserinin doğru teşhisinin invazif olmayan bir yöntemle mümkün olabilmesidir. miRNA'lar küçük kodlamayan RNA'lardır ve mRNA degradasyonu veya post-translasyonel düzenleme yoluyla hedef genlerin ifadesini bastırırlar. miRNA'lar, kanser biyobelirteçleri olarak yüksek potansiyele sahiptir çünkü tümör baskılayıcı olarak hareket edip onkojenik gen ifadesini bastırabilirler veya onkojenik miRNA olarak davranıp tümör baskılayıcı gen ifadesini baskılayabilirler. Biz bu bilgilerden yola çıkarak, birkaç aday eksozomal tümör baskılayıcı ve onkojenik miRNA belirledik ve çalışmamıza en güçlü miRNA adaylarıyla devam ettik. Çalışmanın başında, eksozomları verimli bir şekilde izole ettiğimizi akış sitometrisi, Dinamik Işık Saçılımı Spektrometresi (DLS), Nanopartikül İzleme Analizi (NTA) ve Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) gibi çeşitli tekniklerle doğruladık. Daha sonra prostat kanseri PC-3 hücre hattında aday miRNA'ların ekspresyonunu inceledik. Literatür araştırma bulgularımızla uyumlu olarak, miR-107, miR-139, miR-145 ve miR-204 ekspresyon seviyelerinin, sağlıklı üriner ekzsozomlara kıyasla PC-3 eksozomlarında anlamlı derecede düşük olduğunu bulduk. Diğer yandan miR-21-5p, miR-375-5p ve miR-574-3p PC-3 hücre hattında yukarı regüle edildi. Diğer bir aday miRNA olan miR-30a seviyesi için PC-3 eksozomları ve sağlıklı eksozomlarda neredeyse hiçbir bir fark gözlenmedi. Bu önbulguların ardından miRNA seviyelerinin prostat kanseri hastalarındaki değişimlerini görmek için 17 prostat kanseri hastasından idrar örnekleri topladık. İlk olarak bu hastaların PSA düzeyi-yaş ve PSA düzeyi-Gleason Skor korelasyonlarını analiz ettik. Analizlerimiz PSA düzeyinin yaşla arttığını ve PSA'nın Gleason Skoru ile korele olmadığını ortaya koydu. PSA'nın tümör oluşumuna ek olarak farklı çeşitli nedenlerden etkilendiği ve hastalığın ilerlemesi ile ilişkili olmadığı sonucuna vardık. Yine bu, prostat kanseri için PSA testinden daha duyarlı bir tanı yönteminin gerekli olduğunu destekleyen bir bulguydu. Prostat kanseri hastalarının ve sağlıklı kişilerin idrar ekzozomlarında aday miRNA'ların ekspresyon seviyelerini tespit ettiğimizde miR-107, miR-139, miR-145 ve miR-204'ün azaldığını gözlemledik, miR-375-5p ise hastaların üriner ekzozomlarında yukarı regüle edildi. miR-21 seviyelerinde çok az bir artış vardı ve miR-30a-5p ve miR-574-3p seviyeleri sağlıklı ve hastada neredeyse aynıydı. Ayrıca, bu miRNA'ların hasta grubumuzdaki tanısal potansiyelini merak ettik ve bunlar için Alıcı İşletim Karakteristiği (ROC) analizi gerçekleştirdik. miRNA'larımız kombinasyon olarak kullanıldıklarında hastaları sağlıklılardan ayırt etmede % 77 (AUC = 0.7731) doğruluğa sahipti. Daha sonra, farklı PSA seviyelerine sahip hastaların farklı miRNA ekspresyon profillerine sahip olabileceği hipotezi ile miRNA düzensizliklerini inceledik. PSA<10 ng/ml ve PSA=10-15 ng/ml olan hastaların eksozomlarında miRNA ekspresyonunun beklentilerimizle çok benzer olduğunu gördük; çoğu tümör baskılayıcı miRNA'nın aşağı regülasyonu ve onkojenik miRNA'nın yukarı regülasyonu söz konusuydu. PSA>15 ng/ml olan hastalar kendilerine özgü bir profile sahipti ve tüm miRNA'ların seviyeleri hastalara göre düşüktü. Örnek sayısının az olması nedeniyle, aday miRNA'ların tanısal potansiyelini yalnızca PSA<10 ng/ml olan hastaların eksozomlarında test ettik ve AUC'nin 0.8500 olduğunu gözlemledik. Bu, aday miRNA'larımızı kullanarak hastaları ve sağlıklıları % 85 doğrulukla ayırt edebildiğimiz anlamına gelmektedir. Sonuç olarak, bu çalışmadan elde edilen veriler, tezde önerdiğimiz aday üriner eksozomal tümör baskılayıcı ve onkojenik miRNA'ların, prostat kanseri tanısında potansiyellerinin çok yüksek olduğunu ve buna ek olarak farklı PSA düzeylerine sahip hastalarda regülasyonlarının farklı olduğunu göstermiş ve bu çalışma invazif olmayan prostat kanseri tanı yöntemi geliştirilmesinin yolunu açmıştır. Anahtar Sözcükler: Eksozom, miRNA, idrar biyobelirteci, prostat kanseri, tanı