İnsan A549 hücre hattında sigara dumanı özütünün olumsuz etkileri

Sigara kullanımı kronik akciğer hastalıklarının patogenezi ile doğrudan ilişkilidir. Sigara içeriğindeki 7000'den fazla zararlı madde, epiteliyal-mezenkimal geçiş (EMT)'i uyarabilir. EMT, idiopatik pulmoner fibrozis (IPF), kronik obstruktif akciğer hastalığı ve akciğer kanserinin patogenezinde etkilidir. Yapılan çalışmalar, D vitamininin fibrotik dokularda anti-fibrotik ve kanserde ise EMT'yi geriletici etkileri olduğunu göstermektedir. Ayrıca IPF hastalarında D vitamini eksikliği olduğu bilinmektedir. Çalışmamızda (The present study), sigara ekstraktı özütü (CSE) ve TGF-β ile uyarılan A549 hücrelerinde EMT aracılı miyofibroblast farklılaşmasının, eksojen D vitamini (kolekalsiferol) ile önlenip önlenemeyeceği test edildi ve D vitamininin EMT ile ilişkili transforme edici büyüme faltörü-beta (TGF-β) ve Wnt/β-katenin sinyal yolları ve çeşitli proteinlerle olan muhtemel etkileşimi araştırıldı. İnsan A549 hücrelerinin bir kısmı, %5 CSE ve %5CSE+ 5ng/ml TGF-β ile uyarıldılar. Diğer bir grup hücre ise 50 nM D vitamini ile muamele edildikten yarım saat sonra %5 CSE ve %5CSE+TGF-β uyarıldı. Tüm hücreler, %5 CSE ve TGF-β uygulamalarını takip eden 24., 48. ve 72. saatlerde toplandılar. D vitaminin toksik olmayan dozu, MTT analizleri ile belirlendi. Hücre lizatlarında Western emdirimi yöntemi ile E-kaderin, α-SMA, p-VDR, p-SMAD2/3, SMAD4, SMAD7, aktif β-katenin, DKK1, p120ctn, Kaiso ve NEDD9 proteinlerinin seviyelerindeki değişiklikler belirlendi. İmmünfloresan yöntemi ile p-VDR/Kaiso ve p-VDR/p-SMAD2/3 proteinlerinin hücre içerisindeki konumları belirlendi. Fibrotik (IPF'li, n=3) ve fibrotik olmayan (n=4) insan akciğer örneklerinde, ko-immünpresipitasyon ile p-VDR ve aktif β-katenin, Kaiso ve p120ctn proteinleri ilişkilerine bakılarak, aralarındaki fiziksel etkileşim incelendi. %5 CSE ve %5 CSE+TGF-β ile uyarılan A549 hücrelerinde zamana bağlı olarak, p-VDR ve E-kaderin protein seviyelerinin azalıp, α-SMA seviyelerinin arttığı; TGF-β sinyal yolu elemanlarından p-SMAD2/3 ve SMAD4 seviyelerinin artarken, SMAD7 seviyelerinin azaldığı; Wnt sinyal yolu elemanlarından aktif β-katenin seviyelerinin artıp, DKK1 seviyelerinin azaldığı tespit edildi. Ayrıca bu hücrelerde, E-kaderin stabilizasyonunda görevli olan Kaiso ve p120ctn seviyelerinin ve E-kaderinin yıkımından sorumlu olan NEDD9 seviyelerinin de zamana bağlı olarak arttığı saptandı. CSE ve TGF-β uygulamalarından yarım saat önce A549 hücreleri 50 nM D vitamini ile muamele edildiklerinde, uyarılan p-VDR sinyalleme, E-kaderin seviyelerini arttırıp, α-SMA seviyelerini azaltarak EMT'nin gerilemesine sebep oldu. Ayrıca, p-SMAD2/3 ve SMAD4 protein seviyelerinin azalması, SMAD7 seviyelerinin artması nedeniyle TGF-β sinyal yolu aktivasyonunun; aktif β-katenin protein seviyelerinin azaltılması ve DKK1 seviyelerini arttırılması yolları ile de Wnt sinyal yolu aktivasyonunun azaldığı belirlendi. Ayrıca, D vitamini uygulamaları, %5 CSE ve %5 CSE+TGF-β ile uyarılan A549 hücrelerinde p120ctn, Kaiso ve NEDD9 protein seviyelerini azaltarak E-kaderin yıkımını önlediği saptandı. İmmünfloresan analizler, CSE ve TGF-β uygulanan gruplarda hücrelerin sitoplazma ve nukleusunda görülen p-VDR immunoreaktivitesinin (IR) azaldığını göstermektedir. Bu gruplarda ayrıca nuklear p-SMAD2/3-IR'nin arttığı, Kaiso-IR'nin ise sitoplazmada artarak nukleus periferinde yoğunlaştığı belirlendi. D vitamini uygulanan gruplarda ise sitoplazmik ve nuklear p-VDR-IR artarken; p-SMAD2/3-IR'nin çoğunlukla sitoplazmada, Kaiso-IR'nin ise nukleus ve nukleus periferinde yoğunlaştığı tespit edildi. Yapılan ko-immünopresipitasyon analizler, IPF'li insan akciğerlerinde p-VDR proteinin Kaiso ve aktif β-katenin ile fiziksel olarak etkileşebileceğini, p-VDR'nin p120ctn ile bağlantı kurmadığını ortaya koydu. %5 CSE ve %5 CSE+TGF-β uygulamaları, A549 hücrelerinde p-VDR sinyallemenin azalmasına bağlı olarak TGF-β ve Wnt/β-katenin sinyal yollarının aktivasyonunu, E-kaderin stabilizasyonunu ve yıkımını düzenleyen p120ctn ve NEDD9 proteinlerin ekspresyonunun uyarır. Bu durum, A549 hücrelerinin E-kaderin protein miktarını azaltıp, α-SMA proteinini üretmeye başlamalarına neden olarak hücreleri EMT aracılı miyofibroblast farklılaşmasına yönlendirmektedir. Bu sonuçlar, sigara içiciliği, sigara içiciliğine eşlik eden TGF-β sinyal yolunun aşırı aktivasyonu ve azalan VDR sinyallemenin, IPF gelişiminde önemli risk faktörleri olabileceğini açıkça göstermektedir. Ayrıca, çalışmamızın verileri, CSE ve TGF-β uygulamalarından yarım saat önce A549 hücrelerinin 50 nM D vitamini ile muamele edildiklerinde, bu hücrelerde VDR sinyallemenin artmasının DKK1, aktif β-katenin ve Kaiso proteinleri aracılığı ile TGF-β ve Wnt/β-katenin sinyal yollarının aktivasyonunun azalmasını sağlayarak A549 hücrelerini EMT'ye karşı koruduğunu ortaya koymaktadır. İlaveten, VDR sinyalleme β-katenin ve Kaisonun transkripsyonel aktivitesini kontrol ederek hücrelerde Wnt/β-katenin sinyal yolunun aktivasyonunu düzenler. Sigara içiciliği, sigara içiciliğine eşlik eden TGF-β sinyal yolunun aşırı aktivasyonu ve azalan VDR sinyalleme, EMT'ye neden olduğu için IPF gelişimine sebep olabilirler. D vitamini eksikliği olan IPF hastalarında tedavisinde kullanılan terapötiklerin yanında ek destek olarak D vitamini kullanımı önerilebilir.