İnsan A549 hücreleri metastazı üzerinde D vitamininin etkisi

Tüm akciğer kanserleri içinde en sık görülen akciğer adenokarsinomu, erken evrede belirti göstermemesi, hızlı ilerleyici tipte olması, tespit edildiğinde çoğunlukla metastatik özellik gösteren evre IV'de olması ve uzak organ metastazı varsa sağ kalım süresinin 5 ayın altına düşebilmesi gibi özellikleri nedeniyle insan sağlığını ciddi ölçüde tehdit etmektedir. Transforme edici büyüme faktörü-beta (TGF-β) tarafından uyarılan epiteliyal mezenkimal geçiş (EMT), akciğer adenokarsinomunda tümör metastazına katkı sağlar. Metastazın önlenmesi, kanser terapisinde hedeflenen yöntemlerden biridir. Yapılan çalışmalar, akciğer kanserinin önlenmesinde yeterli D vitamini (VitD) düzeylerinin önemli olabileceğini göstermektedir. VitD'nin, EMT regülasyonunda etkili olduğu bilinir. EMT'de en karakteristik özellik, epitel hücrelerinde görülen E-kaderin protein kaybıdır. Bu nedenle, tümör gelişiminin ve yayılımının önlenmesinde E-kaderin protein kaybının önlenmesi büyük önem taşımaktadır. VitD'nin akciğer adenokarsinomunda E-kaderin proteinini kodlayan CDH1 geni promotörünün metilasyonu üzerinde etkisi bilinmemektedir. Çalışmamızın amacı, TGF-β ile EMT uyarımı yapılan insan A549 hücrelerinde, VitD uygulamalarının CDH1 promotör metilasyonundaki etkisini ve bu süreçte etkili molekülleri belirlemektir. Çalışmada, A549 hücrelerinden üç deney grubu oluşturuldu. Birinci gruptaki hücreler TGF-β (5ng/ml), ikinci gruptaki hücreler TGF-β uygulamasından yarım saat önce 100 µM VitD, üçüncü gruptaki hücreler sadece VitD ile muamele edildiler. Madde uygulamalarından 24, 48 ve 72 saat sonra toplanan hücrelerden DNA/RNA ve protein izolasyonları yapıldı. TGF-β ile EMT uyarımı yapılan A549 hücrelerinde, VitD uygulamaları yapılan ve yapılmayan deney gruplarında, EMT etkinliği, CDH1 promotör metilasyonu, Kaiso ve DNA metiltransferaz 3 alfa (DNMT3A) gibi DNA metilasyonunda etkili moleküllerin ekspresyonlarındaki değişimler, Western blot, QRT-PCR ve bisülfit conversion metilasyon analizleri ile belirlendi. Ayrıca, yara kapanma analizleri ile VitD'nin hücre migrasyonunu engellemede etkinliği değerlendirildi. TGF-β uygulamaları, E-kaderin proteini ve CDH1 mRNA miktarını azaltırken, CDH1 promotör metilasyonu ile Snail, Kaiso, DNMT3A, ACTA2 mRNA ve alfa-düz kas aktin (α-SMA) moleküllerinin ekspresyonlarını arttırdı. VitD ön uygulamaları, A549 hücrelerinde TGF-β tarafından uyarılan EMT'yi geriletti. VitD, TGF-β sinyal yolu aktivasyonunu düşürerek, CDH1 promotör hipometilasyonuna, CDH1 geninin baskılayıcı transkripsiyon faktörü olan Snail proteinin miktarı ile CDH1 promotörünün metilasyonunu düzenleyen Kaiso ve DNMT3A proteinlerinin miktarlarının azalmasına neden oldu. Böylece, A549 hücrelerinde E-kaderin protein miktarının artmasını, α-SMA miktarının ise azalmasını sağladı. Çalışmamız, EMT'nin azaltılması yoluyla metastazın önlenmesinde VitD'nin kullanımının olabileceğine dair in vitro'da kanıtlar sunmaktadır. Çalışmamızın verileri, VitD'nin A549 hücrelerinde CDH1 susturumunu DNA metilasyonu kontrolü üzerinde, EMT'yi gerileterek tümör metastazını önlemede etkili olabileceğini göstermektedir. Deneysel verilerin, klinik çalışmalarla test edilmesi, akciğer adenokarsinomunda VitD'nin anti-kanserojenik terapötiklerle kombine kullanımının faydalı olup olmayacağını belirleyecektir.