HEPG2 hücrelerinde mitokondriyal kenetsizlenme sonucunda değişen BMAL1 ifadesinin araştırılması

Mitokondriyal membran potansiyelinin bozulmuş olduğu HepG2 hücrelerinde, bir moleküler saat proteini olan BMAL1'in ritmik ifade paterninin bozulduğu ve ifade seviyesinin oldukça düştüğü literatürdeki bir çalışmada ortaya konmuştur; ancak BMAL1 proteinin ifade seviyesindeki bu değişimlerin nasıl gerçekleştiği açığa kavuşturulamamıştır. Bu çalışmada, BMAL1 protein ifadesindeki değişimlerin hangi yolak doğrultusunda gerçekleştiği araştırılmıştır. Öncelikle, serum şoku uygulamasıyla HepG2 hücrelerinin senkronizasyonu sağlanıp BMAL1 proteinin ritmik ifade paterni immunoemdirim tekniği ile elde edilmiştir. BMAL1 proteinin en yüksek ifade seviyesine ulaştığı zaman dilimi ise Cosinor analizi ile, daha sonraki immunoemdirim deneylerinde bu saat örneğini kullanmak üzere, 12. saat olarak tespit edilmiştir. FCCP uygulanan hücrelerde oksidatif fosforilasyonun kenetsizlenmesi sonucunda mitokondriyal membran potansiyelinde bozulma olup olmadığı Rhodamine123 ve MitoTracker Green FM ile boyanan hücrelerin konfokal lazer taramalı mikroskopta incelenmesi ile test edilmiştir. Bunun sonucunda, FCCP uygulanmış hücrelerin mitokondriyal membran potansiyelinde yüzde 79'luk bir düşüş tespit edilmiştir. Daha sonra, BMAL1 ifadesindeki değişimlerin bir deasetilaz olan SIRT1 aracılığıyla gerçekleştiği hipotezine dayanarak, hücrelere bir SIRT1 inhibitörü olan EX527 uygulanmıştır. EX527'nin etkinliğini tespit etmek için toplam protein asetilasyonu seviyesi immunoemdirim tekniğiyle incelenmiştir. Beklendiği gibi, toplam protein asetilasyonunda anlamlı artışlar gözlenmiştir. Son olarak, FCCP, EX527, FCCP ve EX527 uygulanmış örnekler arasında BMAL1 seviyesindeki farklılıklar immunoemdirim tekniğiyle incelenmiştir. Literatürdeki bulgulara uygun olarak, FCCP uygulanmış örneğin BMAL1 seviyesinde kontrole göre yüzde 63'lük bir azalma tespit edilmiştir; ancak FCCP ve EX527'nin birlikte uygulandığı örnekte BMAL1 seviyesinin kontrole yakın olduğu bulunmuştur. Dolayısıyla, SIRT1 enziminin aktivitesinin HepG2 hücrelerinin BMAL1 seviyesinde FCCP uygulaması ile meydana gelen azalmaya yol açan yolak üzerinde etkisi olduğu çıkarımı yapılmıştır.