A novel role for 5-hmC in the regulation of cancer testis gene expression in cancer and mesenchymal to epithelial transition

Kanser testis (KT) genleri normal dokular içinde sınırlı şekilde sadece yumurtalık ve testislerdeki eşey üreme hücreleri ve trofoblast hücrelerinde ifade edilirken, pek çok kanserde sıklıkla ifade edildiği gözlenmiştir. Promotor bölgesine özgü DNA demetilasyonu ve histon deasetilasyonuyla ilgili açık bir ilişki haricinde bu genlerin ifade edilmesindeki spesifik mekanizmalar bilinmemektedir. Bu calışmada KT gen ifadesini daha iyi anlayabilmek icin KT genlerini bulunduran promoter bölgelerine özgü ve alana sınırlı epigenetik mekanizmaları test ettik. KT gen ifadesi varliginda ve yokluğundaki epigenetik mekanizmalari daha iyi calışabilmek için, KT genlerini dinamik olarak ifade eden bir model aradık. Öncü biyoinformatik analizler ve literatür araştırması sonucunda, KT genlerini Caco-2 farklılaşmasında incelemeyi seçtik. PAGE-2,-2B ve SPANX-B gen ifadelerinin farklılaşan Caco-2 hücrelerinde anlamlı şekilde arttığını gösterdik. Mezenkimal belirteç gen ifadeleri (Fibronectin1, Vimentin ve Transgelin) azaldığı ve eş zamanlı olarak epitel belirteç gen ifadeleri (E-cadherin, Claudin 4 ve Cdx2) arttığı için farklılaşma mezenkimalden epitele geçiş süreci olarak tanımlanmıştır. Bunun yanısıra, KT proteinlerini (SPANX-B ve PAGE-2,-2B) bulunduran hücrelerin epitel belirteç proteinini (CDX2) de bulundurduğu, mezenkimal belirteç proteinlerini (Fibronectin1 ve Vimentin) de bulundurmadığını gösterdik. Farklılaşmış Caco-2 hücrelerinde artan KT genlerinin promotor yakınındaki DNA bölgelerinde anlamlı demetillasyon gözlemlenmemekle birlikte bu bölgelerde hidroksimetilasyon seviyelerinde aşamalı bir artış tespit edilmiştir. Promotor yakını bölgelerdeki hidroksimetilasyon seviyesindeki artış aynı zamanda TET enzim seviyesindeki artış ile ve de TET2 proteini ve KT proteinlerinin aynı hücrelerdeki konumlanması ile uyumlu bulunmuştur. Bunların yanısıra, KT gen ifadesi ile birlikte KT genlerinin promotor bölgelerindeki EZH2 ve HP1 proteinlerinin işgali ve H3K27me3 işareti azalmıştır. Caco-2 farklılaşması tersine döndürüldüğünde KT ve TET gen ifadelerinin azalması ve epitelden mezenkimale geçiş ile sonuçlanmıştır. Böylece bu calışma ile ilk defa KT genlerinin dinamik ifadesi gösterilmiş, bu süreç mezenkimalden epitele geçiş ve DNA hidroksimetilasyonu ile açıklanmıştır. Promotor yakını bölgelerdeki değişimlerin yanısıra, kanserde KT gen ifadesine sebep olan epigenetik değişikliklerle alternatif epigenetik değişikliklerin aynı anda sınırları belli farklı bölgelerde meydana geldiğini düşündük. KT genleri ve KT genlerine komşuluk eden ama KT gen ifade paterninden farklı gen ifadesine sahip olan genler arasında sınırlar olabileceğini hipotezledik. Boylece, KT genlerine (PAGE-2,-2B ve SPANX-B) komşuluk eden ve kanserde gen ifadesi azalan 2 geni, ALAS2 ve CDR1'i, bulduk. ALAS2 ve CDR1 gen ifadelerinin sağlıklı dokulara kıyasla kolon ve akciğer kanseri hücre hatlarında azaldığını gösterdik. ALAS2 ve CDR1 gen ifadelerinin kanser hücre hatlarındaki azalışlarının KT gen ifadesinden farklı olarak DNA metilasyonundan bağımsız oldugunu bulduk. Kanserde ALAS2 ve CDR1 gen ifadesi azalışlarının promotor yakını bölgelerdeki artan hidroksimetilasyon seviyesi ile kuvvetli ihtimal ilişkili olabileceğini gözlemledik. PAGE-2,-2B ve SPANX-B gen ifadelerindeki artış da DNA hidroksimetillasyonu ile ilişkili bulunmustur, bu iki grup genlerinin farklı ifade paternlerine rağmen. Kanser hücre hatlarındaki ALAS2 ve CDR1 gen ifadelerinin çarpıcı azalışına rağmen, bu genlerin kanser hücrelerindeki ektopik ifadeleri sonucu hücre canlılığı ölçümlerinde anlamlı bir değişiklik bulunmamıştır. ALAS2 ve CDR1, sırasıyla PAGE-2,-2B ve SPANX-B genlerine 200 ve 50 kbs uzaklıkta konumlandığından, bu bölgeler arasında farklı epigenetik olayların meydana gelmesinde etkili yalıtkan bir sınır bulunduğunu önermekteyiz. KT genlerinin neredeyse tamamı yüksek homolojik benzerliği bulunan tekrar bölgelerinde konumlandığından, bu tekrar bölgelerinin katlanarak 3 boyutlu yapılar oluşturması ve bu yapıların eş güdümlü KT gen ifadesinden sorumlu mekanizma olması muhtemeldir. Bu hipotezi test etmek icin, NY-ESO-1 genini içeren tekrar bölgesinin içindeki ve dışındaki genlerin ifadesini inceledik. Ancak anlamlı bir ilişki tespit edemedik. Anahtar sözcükler: Kanser testis genleri, PAGE-2,-2B, SPANX-B, DNA hidroksimetilasyonu, mezenkimalden epitele geçiş