Regulation of olfactory receptor gene choice by negative regulatory elements

Koku alma sisteminde, her bir koku duyu nöronu tipik olarak çok geniş genomik repertuvardan sadece bir tek koku reseptör geninin bir tek alelini ifade eder. Ancak, koku reseptörü gen seçim mekanizması, çok iyi anlaşılamamıştır ve epigenetik değişiklerle kontrol edilebilecği gibi cis-düzenleyici diziler tarafından bölgesel olarak da kontrol edilebilir. Hem proksimal promotör bölgelerinin hem de uzun mesafeli etkileşen elementlerin koku reseptörü gen seçimine katkıda bulunduğu görülmüştür. Bu çalışmada, gen ifadesi üzerinde önemli rol oynayan elementler geçici transgenik yaklaşım kullanılarak zebrabalığı koku reseptörü modeli, OR101-1, üzerinde tanımlandı ve bu elementler işlevsel olarak test edildi. Özellikle, OR101-1 geninin 2 kb yukarısında bulunan 500 bp dizisinin (500i) negatif düzenleyici etkisi araştırıldı. 'Promotor bashing' yaklaşımı kullanılarak, 500 bp dizisini içeren transgenik yapıların hem floresan ropörtör transgenini anlatan embiriyo sayısında hem de embriyo başına düşen koku duyu nöron sayısında daha az etkili olduğu gösterildi. Düzenleyici etkiyi daha derinden incelemek için, güçlü bir koku reseptörü promotörünün yukarısına 500i bölgesi klonlanarak yeni transgenik yapılar oluşturuldu ve erken embriryolarda transgen anlatımı skorlandı. Bölgenin dahil edilmesi transgen anlatımını %50 kadar düşürdü. Daha sonra 500i bölgesinin içinde bulunan iki aday transkripsiyon faktör bağlanma yeri, bölgesel yönlendirilmiş mutasyon kullanarak incelendi. Transgenik yapılardan yerlerinden birinin veya ikisinin silinmesi yüksek seviyedeki transgen anlatımını kurtarmak için yeterli oldu ve bu yerlerin ve bu yerlere bağlanan transkripsiyon faktörlerinin gözlemlenen baskılayıcı etkiden sorumlu olabileceğini gösterdi. Bu tür düzenlemenin biyolojik işlevini daha fazla aydınlatmak amacıyla, dizinin OR101-1 promotörünü yakındaki artırıcıların etkisinden korumak için yalıtıcı olarak davranıp davranmadığı test edildi. Gerçekten de 500i'nin güçlü artırıcı ile OR101-1 promötörünü ayırması transgen anlatan koku duyu hücrelerinin sayısında azalmayla sonuçlandı. Şüphelenilen transkripsiyon faktör bağlanma yerinin mutasyonu, artırıcının etkisini kısmi olarak kurtardı. Bu buluşlar ilk defa koku reseptörü geninin anlatımının baskılayıcı düzenleyicilerin etkisi altında olduğunu işlevsel olarak gösterdiği için önem arzetmektedir.