Analysis of 45S rDNA promoter methylation and expression of rRNA transcripts in breast cancer

Tümör hücrelerinde genellikle tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu ve onkogenlerin aktifleştirilmesi ile bozulan ribozom biyogenezi hücre büyümesi ve bölünmesinde merkezi bir rol oynar. Ribozomal RNA (rRNA) gen ifadesi ribozom üretimini düzenleyen en önemli faktörlerden biridir ve CG'ler bakımından zengin 45S ribozomal DNA (45S rDNA) promotörü tarafından kontrol edilir. 45S rDNA promotörünün rRNA ifadesi üzerindeki etkisi literatürde tartışmalı bir konudur. Bu tezde, 54 CpG içeren, 45S rDNA promotöründe bulunan yukarı kontrol elementini (Upstream control element, UCE) ve çekirdek promotörü (Core promoter, CP) kapsayan 434 bç lik bir bölge meme kanserinde bisülfit dizileme yöntemi kullanılarak analiz edilmiştir. 45S rDNA promotör metilasyonunun rRNA gen ifadesindeki rolünü netleştirmek için aynı örneklerde ilgili rRNA ifade düzeylerini de analiz ettik. 45S rDNA promotör bölgesi tümörijenik olmayan meme hücre hattı (MCF10A) da dahil olmak üzere tüm meme kanseri hücre hatlarında oldukça metillenmiştir. Her ne kadar 45S rDNA promotör bölgesi hücre hatlarında yoğun biçimde metillenmiş olsa da rRNA'lar (18S, 28S, 5.8S ve 45S ETS) bu ağır metilasyondan bağımsız olarak ifade olmuşlardır. rRNA'ların ifade düzeyleri ya referans genleri (ACTB, TBP, ACTB&TBP) yada rRNA'ların geometrik ortalaması (GM-rRNAs) kullanılarak değerlendirilmiştir. GM-rRNA normalizasyonunu rRNA'lar arasındaki göreceli farklılıkları tanımlamak için yeni bir yöntem olarak öneriyoruz. DNA metilasyonu ve histon asetilasyonunun rRNA ifadesi üzerindeki etkisini belirlemek için epigenetik ilaçlar 5-Aza-2'-deoksisitidin (5-AZA) ve Trikostatin A (TSA) kullanılmıştır. 5-AZA ile demetilasyon TBP, ACTB veya ACTB&TBP normalizasyonları ile tüm rRNA türlerinde beklenmedik bir azalmayla sonuçlanmıştır. TSA muamelesi hücre hatlarında anlamlı bir ifade farkına sebep olmadı. DNA metilasyonunun rRNA transkriptlerinin ifadesi üzerindeki etkisini daha iyi değerlendirmek için 19 dondurulmuş meme tümörü ve eş normal doku örneklerinin metilasyon durumları analiz edildi. Sonuçlar tümörlerin çoğunun (13/19) normal eş dokularına göre metilasyon seviyelerinin anlamlı olarak daha yüksek olduğunu gösterdi. Referans gen olarak GM-rRNA'yı kullanmamız bu doku örneklerinde rRNA'ların ifadesindeki anlamlı oransal farklılıkları belirlemek için bize yardımcı olmuştur. Meme kanseri örneklerinde 5.8S rRNA oranı anlamlı olarak düşük iken 18S rRNA oranı anlamlı olarak yüksektir. Ayrıca normal meme dokularında 45S rDNA promotör metilasyon seviyeleri ile 18S rRNA oranı negatif olarak korele ederken bu korelasyon meme tümörlerinde bozulmuştur. Benzer şekilde normal doku örneklerindeki rRNA transkriptlerinin seviyeleri birbirleri ile korele ederken tumor hücrelerinde bu kaybolmuştur. Hem rDNA promotör metilasyon seviyelerinde hem de kırpılan rRNA transkriptlerinde meme tümör örneklerine özgü normal meme dokularında gözlemlenmeyen bir bozulma olduğu açıktır. rRNA gen ifadesinin meme kanserinde promotör DNA metilasyonundan başka mekanizmalar tarafından kontrol edilmektedir. Tümörigenez, düzgün rRNA ifadesi, kırpılması ve olgunlaşması için gerekli birçok kontrol mekanizmasının bozulmasına neden olabilir ve bu kırpılmış rRNA ifade seviyelerindeki korelasyonun bozulmasıyla sonuçlanan durumun daha iyi araştırılması gerekir.