Synthetic genetic circuits to monitor nanomaterial triggered toxicity

Son bir kaç onyıl içerisinde çeşitli alanlarda nanomalzeme kullanımı artmıştır. Bunun temel sebeplerinden biri, nanomalzemelerin sahip olduğu eşsiz özelliklerdir. Bu özelliklerden başlıcaları, boyuta bağlı olarak değişen ve ayarlanabilen optik ve fiziksel özelliklere sahip olmalarıdır. Artan nanomalzeme kullanımı ile bu malzemelerin insan ve çevre üzerindeki etkilerine dair endişeler de artmaktadır. Küçük boyutları sayesinde nanomalzemeler, hücre duvarlarından kolayca geçebilmektedir. Aynı zamanda, yüksek yüzey alanı-hacim oranı sayesinde bu malzemeler katalitik olarak oldukça aktif olabilmektedirler. Bunun sonucunda da hücre içerisinde stres yaratma potansiyeline sahiptirler. Bu stres belirtilerinin başlıcaları protein katlanmalarında hatalar, reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşması ve DNA hasarıdır. Bu yüzden, nanomalzemelerin insan üzerinde kullanımından önce (kontrollü ilaç salınımı ya da manyetik görüntüleme gibi) bir takım biyouyumluluk testinden geçmesi gerekmektedir. Yine de, günümüzde kullanılan biyouyumluluk testleri oldukça komplike olmakla birlikte geç sonuç vermektedir. Bu tezin amaçlarından biri, hızlı cevap verebilen yaşayan bir biyouyumluluk testi oluşturmaktır. Bu sayede, toksik olan nanomalzemelerin modifikasyonları daha erken yapılabilecek, böylelikle toksik olmayan nanomalzemelerin kullanıma girmesi daha hızlı olabilecektir. Bu doğrultuda genel bir stres göstergesi olan ısıl-şok protein mekanizması (HSR) seçilmiştir. Bu mekanizma, sentetik biyoloji yaklaşımları kullanılarak yeniden düzenlenmiş ve sentetik gen devreleri oluşturulmuştur. Öncelikle, stres durumunda en çok aktif rol alan dört farklı proteinin promotör bölgeleri seçilmiştir. Bu promotörlerin her biri ile ayrı ayrı gen devresi oluşturulmuştur. Bu gen devrelerinde, her bir promoter, bir raportör gen ifadesini kontrol etmektedir. Yapılan ilk denemeler sonucunda elde edilen bulgulara göre, ısıl-şok proteinleri hücre savunma mekanizması için rol aldığından oldukça aktif olup, stres olmadığı zamanlarda da yüksek raportör sinyali verdiği gözlemlenmiştir. Bu yüzden, tek başlarına bu promotörlerin kullanılamayacağına karar verilmiştir. Stres kaynağı olmayan durumdaki gürültü sinyalini düşürmek amacıyla, literatürde daha önce geliştirilmiş olan riboregülatör sekanslarının kullanılmasına karar verilmiştir. Böylece her bir promotör riboregülatörler ile yeniden düzenlenmiş, yeni gen devreleri oluşturulmuştur. Elde edilen bulgular, oluşturulan bu yeni sensörlerin, gürültü sinyalini hemen hemen tamamen yok ettiğini göstermiştir. Ancak, stres uygulamasından sonra beklendiği şekilde yüksek sinyal elde edilememiş, riboregülatörler toksisite sinyalini de düşürmüştür. Sensör sinyalini arttırmak amacıyla, sensör içerisinde bir pozitif geribesleme döngüsü eklenmiştir. Bunun için bakteriyel iletişim (QS) mekanizması ile ısıl-şok mekanizması birleştirilmiştir. Bu sayede ortamda var olan stres durumundan bütün bakterilerin haberdar olup birbirini uyarması amaçlanmıştır. Beklendiği üzere sensörün sinyal seviyesi oldukça artmıştır. Ancak bununla birlikte, gürültü sinyalinde de aynı oranda artış gözlemlenmiştir. Bu yüzden, Escherichia coli içerisindeki gibi aktivasyona dayalı ve yüksek gürültü veren sistem kullanmak yerine, baskılamaya dayalı yeni bir sisteme geçilmesi kararlaştırılmıştır. Bu yüzden, Mycobacterium tuberculosis ısıl-şok mekanizması örnek olarak alınmıştır. Oluşturulan gen devreleri, model nanomalzeme olarak kullanılan kuantum noktacıklara (QD) 1 saat içerisinde oldukça yüksek tepki vermiştir. Oluşturulan bu sensörler ile de nanomalzeme toksisitesi oldukça hızlı tespit edilebilecek, karmaşık deneylere (hayvan deneyleri gibi) gerek duyulmadan, toksik olan nanomalzemelerin yeniden gözden geçirilerek modifikasyonlar yapılmasına olanak sağlayacaktır. Bu çalışmasının ikinci kısmı da oluşturulan toksisite sensörlerini kaynak gösterecek şekilde tasarlamak, bu sayede ortamda toksisite yaratan malzemenin ne olduğuna dair rapor elde etmektir. Bunun için de ısıl-şok yolağı ile ağır metal spesifik transkripsiyon faktörleri (altın için GolS, kadmiyum için ise MerR(mut) ve CadR) birleştirilmiştir. Bunun için altın ve kadmiyum iyonları model olarak seçilmiştir. Bu sistemler rekombinaz ile birleştirilerek yeni gen devreleri tasarlanmıştır. Bu gen devrelerinde, rekombinaz, stres ile aktive olarak ters halde duran metal spesifik promotörü düzleştirmekte, bu sayede de ilgili metal varlığında raportör gen ifadesi başlamaktadır. Bu sayede stres faktörünün kaynağının altın ya da kadmiyum olarak belirlenmesi mümkündür. Son olarak, memeli hücresi kullanılarak toksisite sensörü yapılması amaçlanmıştır. Öncelikle, bakteriler ile yapılan yaklaşımlara benzer şekilde, stres durumunda aktif rol oynayan iki farklı ısıl-şok protein ailesi seçilmiştir. Bunlardan birincisi, hücrelerin genel savunma mekanizması olan HSP70 ailesi iken, diğeri de küçük ısıl-şok protein ailesine ait α-Bcrystallin proteinidir. Her iki proteinin promotör bölgesi raportör gen ifadesini kontrol edecek şekilde tasarlanmıştır. Oluşturulan her iki devre de ısı ve kadmiyum iyonları ile test edilmiştir. HSP70 ailesi hücre içerisinde oldukça aktif olduğundan, stres uygulanmayan durumlarda da yüksek sinyale sebep olmuştur. α-Bcrystallin ile oluşturulan sensörde ise, ısıl-şokun ardından bir miktar artış gözlense de, sensör çalışmaları için yeterli değiltir. Bu sebeple, bakteriyel sensörlerde yapıldığı gibi baskılayıcı gen devresi tasarımına karar verilmiştir. Öncelikle, ısıl-şok promotörlerini baskılayıcı genin (HspR) memeli hücrelerde de ifade edilebildiği gösterilmiştir. Daha sonrasında minimal promotör bölgesine (SV40) HspR bağlanma dizileri tekli ve çiftli tekrarlar halinde eklenerek raportör gen ifadesindeki azalış ve artışlar takip edilmiştir. Oluşturulan devreler ısıl-şok ve kadmiyum iyonları ile test edilmiştir. Elde edilen sonuçlara gore, HspR varlığında raportör gen ifadesinde azalış olduğu gözlemlenmiştir. Ancak, stres uygulamasının ardından belirgin bir sinyal artışı elde edilememiştir. Bu yüzden, oluşturulan gen devrelerinin optimizasyonunun yapılması ve sensörün optimum çalışma koşullarının tespit edilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır. Sonuç olarak, bu çalışma ile bakteriyel ve memeli bütün hücre sensörü tasarlanma prensipleri ele alınmıştır. Oluşturulan bakteriyel sensörler, nanomalzemelerin toksisite tayini için güçlü bir adaydır. Şimdiye kadar yapılan çalışmaların aksine, bu çalışmada, hücreleri toksisite tayini için programlarken çeşitli mühendislik yaklaşımları kullanılmıştır (riboregülatörler, bakteriyel iletişim mekanisması, promotör üzerinde yapılan çeşitli değişiklikler v.b.). Sonuç olarak, kullanımı kolay, hızlı cevap veren ve ucuz bir toksisite testi elde edilmiştir. Ayrıca, memeli hücresi kullanılarak yapılan biyosensör çalışmasının optimizasyon gerektirmesine rağmen, tüm hücre sensörü alanı için nitelikli bir tasarım örneğidir. Literatürde memeli hücrelerinin toksisite tayini için programlanmasına nadiren rastlanmaktadır. Bu sebeple, buradaki çalışma da Alana önemli bir katkı sağlayacak türden olmuştur. Genel anlamda bu çalışma nanomalzeme toksisitesi tayinini hızlı bir şekilde sağlayarak, toksik olan nanomalzemelerin yeniden yapılandırılarak alana daha hızlı şekilde uygulanabilmesini sağlayacaktır.