Lokusa özgü kromatin proteinleri tamınlanması için yeni bir araç

Genomik DNA, kromatin proteinleri tarafından korunur ve düzenlenir. Kromatin organizasyonunun araştırılması için geliştirlen yöntemler sayısızdır ve kuruludur, ancak belirli bir lokus ile ilişkili yeni kromatin proteinlerini tanımlamak hala bir zorluktur. Bu proje kapsamında, belirli bir genomik bölgeyle ilişkili kromatin proteinlerinin tanımlanması için yeni bir araç uygulamaya çalışıyoruz. Bu yöntem, CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) ve SICAP (Kromatine İlişkili Proteinlerin Seçici İzolasyonu) tekniklerinin birleştirilmesine dayanmaktadır. CRISPR tekniği, istenilen bir bölgeyi hedeflemek için kullanılır ve SICAP tekniği, ikinci bir çöktürme aşaması kullanarak fayda sağlar. İlk çöktürme,dCas9 aracılı ve lokus-pesifiktir, ikincisi ise kromatin fragmanlarının in vitro-biyotinile edilmiş DNA'sının streptavidine bağlanmasına dayanır. İkinci çöktürme, sert denatüre edici yıkamalar yoluyla kirletici maddelerden kurtulmayı sağlar ve elde edilen proteinleri kromatin fraksiyonuyla sınırlar. Elde edilen kromatin proteinleri havuzu elüe edilir ve sonuçta kütle spektrometrisi ile analiz edilmesi amaçlanır. Mevcut çalışmada, yöntemin kritik bileşenleri geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. Ayrıca metodun geçerliliği için model sistemi önerilmiş ve test edilmiştir. CRISPR-SICAP yöntemi, CRISPR-SICAP-qPCR ile farklı genomik bölgelerde problanmış ve normal dCas9-ChIP'den daha spesifik olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar, testin protein araştırmalarının gelecekteki uygulamalarında kullanılabileceğini gösteriyor. CRISPR-SICAP ve model sistemleri, lokus-ilişkili kromatin proteinleri havuzunu elde etmek için optimize edilmiş ve uygulanmaya hazırdır.