Pankreatik beta hücre farklılaşmasında moleküler enerji algılayıcıları ve metabolik değişimlerin rolü

Bu tez çalışmasının amacı, klinikte insülin direnci tedavisinde sıklıkla kullanılan metformin'in doğal bir şeker olan glukoz veya yapay bir tatlandırıcı olan aspartam ile birlikte pankreatik adacık kaynaklı progenitör hücre (PAK-PH)'lere uygulanarak, bu maddelerin in vitro ortamda beta hücre farklılaşması üzerine etkisinin olup olmadığının araştırılması ve olası moleküler mekanizmanın ortaya konmasıdır. Glukoz ve/veya aspartam ve/veya metformin varlığında meydana gelen PAK-PH'lerin beta hücrelerine farklılaşması ile ilgili sinyal yolağının tatlı tat reseptörü ile uyarılan, moleküler enerji algılayıcıları ile etkileşen ve aynı zamanda kök hücre karakterlerinin korunmasında önemli olduğu bilinen Warburg etkisini ortadan kaldıran bir yolak olabileceğini düşünerek çalışmamızı mitokondri merkezli metabolik değişimler üzerine odakladık. Beta hücre farklılaşmasının tespiti için insülin ve reaktif oksijen türleri (ROS) üreten hücreler akım sitometri yöntemi ile belirlendi. Ayrıca, insülin üreten hücreler immuohistokimyasal olarak işaretlendi. Bu farklılaşma mekanizmasında GLUT1'in rolünü göstermek amacıyla hücrelere özgün GLUT1 inhibitörü olan WZB117 uygulandı. NGN3, PAX4, NKX2.2, PDX1, NKX6.1, INS2, GLUT2, Hekzokinaz ve laktat dehidrojenaz A genlerinin ekspresyon seviyeleri ters çevrim-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) metoduyla gösterildi. Hücre metabolizması ile ilgili fikir sahibi olabilmek için laktat, NAD+/NADH, NADP+/NADPH ve hücre içine glukoz alımı seviyeleri kolorimetrik yöntemle ölçüldü. Mitokondriyal kütle mitotracker green işaretlemesi ile fluorometrik olarak belirlendi. Ayrıca, GLUT1, MDH2, UCP2, Sitrat Sentaz,T1R2, T1R3, PLCβ2, CAMKK2, LKB1, p-AMPK(Thr172), p-Akt(Th308)/(S473), Akt, p-mTOR(Ser2448) ve FOXO1 seviyelerindeki değişimler western emdirimi tekniği ile ölçüldü. Hücre içi Ca+2 seviyelerindeki değişiklikler fluorometrik yöntemle belirlendi ve hücreler fluoresanss mikroskop ile görüntülendi. Tüm bu işlemler sonucunda elde ettliğimiz bulgular ve ulaştığımız sonuçlar aşağıda listelenmiştir: Aspartam ve aspartam+glukoz uygulanmasının istatistiksel olarak anlamlı oranlarda beta hücre farklılaşmasına neden olduğu, metformin'in tek başına veya diğer uyaranlarla birlikte uygulanmasının ise daha yüksek oranda beta hücre farklılaşmasını sağladığı tespit edilmiştir. GLUT1 inhibisyonunun metformin+aspartam ve metformin+aspartam+glukoz gruplarında beta hücre farklılaşmasını baskıladığının tespit edilmiş olması aspartam ve metformin varlığında GLUT1'in beta hücre farklılaşmasında önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Beta hücre farklılaşması sırasında anaerobik glikolizden oksidatif fosforilasyona geçiş şeklinde gerçekleşen bir metabolik yeniden programlanma söz konusudur. Özellikle glukoz ile aspartam ve aspartam+glukoz gruplarında kontrol grubuna daha yakın bir metabolik profilin gözlenmesi bu gruplarda farklılaşan hücrelerin yanı sıra PAK-PH'lerin sayıca fazla olabileceğini düşündürmektedir. Metformin uygulanan tüm gruplarda uygulanmayan gruplara göre mitokondriyal kütlede artış gözlense de bu artış yalnızca glukoz+metformin ve aspartam+glukoz+metformin gruplarında istatistiksel olarak anlamlıydı, en belirgin artışın aspartam+glukoz+metformin grubunda meydana geldiği ve UCP2'nin mitokondriyal kütle ile paralel değişim gösterdiği belirlendi. Metformin+aspartam+glukoz grubu hariç T1R2 alt ünitesinin seviyelerinin korunuyor olması sinyalin baskın olarak bu alt ünite aracılığıyla algılandığını düşündürmektedir. Aspartam grubunda sitoplazmik Ca+2 seviyeleri kontrol grubuna kıyasla düşük olsa da Ca+2 ile aktive olan CAMKK2'nin belirgin olarak artmış olması sitoplazmada tatlı tat sinyalini iletmeye yetecek kadar Ca+2'nin bulunduğunu düşündürmektedir. Bu grupta PLCβ2 seviyesinin korunması da tatlı tat sinyalinin tamamen baskılanmadığının diğer bir göstergesidir. Metformin uygulanan gruplarda en belirgin değişiklik sitoplazmik PLCβ2 ve Ca+2 seviyelerinin belirgin olarak azalmasıdır. Buna karşın, yalnızca metformin uygulanan grupta CAMKK2 aracılığı ile artan AMPK aktivasyonu dikkat çekmektedir. Glukoz+metformin grubunda aktif AMPK seviyelerinin değişmemesi ve aktif AKT seviyelerindeki azalmaya karşın artan mTOR aktivasyonun yüksek seviyede bulunan glukoz aracılığıyla meydana gelmesi olasıdır. Metformin ve metformin+glukoz gruplarında FOXO1 seviyeleri artmakta ve bu antioksidan savunmaya işaret etmektedir.