Effects of PI3K/AKT/mTOR and VEGFR pathway inhibitors on liver cancer stem cells and bioactivities of novel pyrazolic chalcone derivatives on liver cancer

Hepatoselüler karsinom (HSK) kansere bağlı ölüm nedenlerinde en ön sıralarda yer almaktadır. Dünyada meydana gelen kanser ölümleri arasında ikinci sırada yer almaktadır. Heterojen yapısı ve agresif davranışı sebebiyle, kemoterapötik ilaçlara ve FDA onaylı, çoğalma ve anjiyojenez yolaklarını hedef alan, multikinaz inhibitörü Sorafenib ve Regorafinibe karşı dirençlidir. Sorafenibe karşı gelişen direncin arkasında yer alan mekanizmalar, PI3K/Akt/Mtor, JAK/STAT gibi dengeleyici yolakların aktivasyonu, epitelyal mesenkimal geçiş (EMG), mikroçevre ve kanser kök hücrelerinin varlığı olarak açıklanmaktadır. Karaciğer kanser kök hücreleri (KKKH) hasara uğramış ve değişime uğramış hepatik öncü hücrelerden meydana gelmişlerdir ve bu hücreler kemoterapi direnci, tümörün nüksetmesi ve metastazı gibi olaylardan sorumludurlar. Bu sebeple, PI3K/Akt/mTOR yolağı inhibitörleri, Sorafenib ve DNA interkalatörlerinin KKKH üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu inhibitörler ile muamele edilmiş HSK hücre hatlarındaki CD133+/EpCAM+ popülasyonu akış sitometrisi ile analiz edilmiş, KKKH'lere karşı etkili olabilen inhibitörler Sorafenib ile kombinasyon deneylerindeki potansiyelleri belirlenmek üzere test edilmiştir. Sonuçlar göstermiştir ki, Sorafenib veya DNA interkalatörleri ile muamele edilen hücrelerde KKKH'leri zenginleşirken, Rapamisin (mTOR inhibitörü), LY294002 (PI3K inhibitörü) CD133+/EpCAM+ popülasyonu oranını düşürüp KKKH zenginleşmesine engel olmuştur. Kombinasyon çalışmaları ile hücrelerin öncelikle Rapamisin ile daha sonra ise Sorafenib ile muamele edilmeleri ile , hem KKKH oranının hem de küre oluşturma kapasitlerinin yalnızca Sorafenib ile muamele edilen hücrelere göre azaldığı gösterilmiştir. İnhibitörlerin hücrelerdeki gen ifade seviyelerinde sebep oldukları değişimleri anlamak için, Nanostring nCounter teknolojisinden faydalanarak, kanser yolaklarını regüle eden genlerin analizi yapılmıştır. Cytoscape Score Flow algoritması uygulaması ile gerçekleştirilen sistemik yolak analizi, kök hücreleşme ile ilgili genlerdeki ifade farklılıklarının belirlenmesine yardımcı olmuştur. Rapamisin veya DAPT (Notch yolağı inhibitörü) ile muamele sonrası kök hücrelerin regülasyonunda yer alan genlerin (Wnt ve Notch yolakları) ifadelerinin azaldığı gösterilmiş, fakat Sorafenib ile muamele sonucunda bu yolaklardaki genlerin ifadelerinde farklılıklar (örn. JAG1 geninde artış) gözlemlenmiştir. İlginç bir şekilde, IL-8 ifadesi Sorafenib ile muamele sonucu artış göstermiş, fakat DAPT veya Rapamisin ile muamele sonucu düşüş göstermiştir. IL-8 yolağının inhibe edilmesi, hem KKKH oranında hem de HSK hücrelerinin sfer oluşturma kapasitelerinde azalmaya sebep olmuştur. Bu da IL-8 yolağının KKKH'ların kök hücre özelliklerini koruyucu bir rölü olduğunu işaret ediyor olabilir. Bu sebeple, IL-8 sinyal yolağının bloke edilmesinin HSK terapisi için umut verici bir yaklaşım olduğu belirtilmiştir. Bu tezde ayrıca, VEGFR2 tirozin kinaz (TK) inhibitörlerinin ve quinoidlerin karaciğer kanseri hücreleri ile beraber KKKH'lerini de inhibe edebilme potansiyelleri ile ilgili çalışmalara odaklanılmıştır. Sorafenib gibi diger VEGFR TK inhibitörleri çoğu kanser çeşidinin tedavisi için yaygın olarak çalışılmaktadır. Fakat, daha önce de belirtildiği üzere, klinik çalışmalar anti-VEGF veya anti-VEGFR terapilerinin farklı kanser türlerinde hastalığı stabile edip daha sonra ilerlemesine sebep olduğu bulguları içermektedir. Son yıllarda anti-anjiyojenik ajanların tümörde hipoksi oluşturarak kanser kök hücre popülasyonunu arttırdığı gösterilmiştir. Buna karşılık olarak, quinoidlerin hipoksik ortama duyarlı ve seçici aktif bileşiklerdir. Bu sebeple, bu çalışmadaki temel amacımız, bu iki grup bileşiklerin HSK hücreleri üzerindeki biyoaktivitelerini belirlemek ve aynı zamanda KKKH'lerinin zenginleşmesi üzerindeki etkilerini analiz etmektir. Sonuçlar göstermiştir ki, VEGFR2 TK inhibitörleri quinoidlere göre çok daha düşük konsantrasyonlarda sitotoksik etkilerini göstermektedir. Buna rağmen, VEGFR2 TK inhibitörlerinin KKKH hücrelerini zenginleştirdiği, quinoidlerin bazılarının ise bu oranı azaltabildiği gösterilmiştir. Bu veriler ile, bir bileşiğin daha agresif bir kansere sebep olma potansiyelini tanımlayan ve "agresiflik faktörü" adı verilen yeni bir kavram ortaya konulmuştur. Tezin son bölümünde ise pirazolik kalkon türevlerinin HSK hücre hatları üzerindeki biyoaktiviteleri ve etki mekanizmaları araştırılmıştır. Kalkonlar ve pirazolik yapılar anti-kanser özellikleri ile bilinen bileşikleridir. Yeni sentezlenmiş 41 adet pirazolik kalkon türevleri ilk önce farklı kanser hücreleri üzerinde test edilmiş, ve aralarından IC50 değerlerine bağlı olarak seçim yapılarak, bileşiklerin etkileri HSK hücre paneli üzerinde test edilmiştir. Sonuçlar, 39, 42, 49 ve 52 bileşiklerinin 5 µM dan küçük konsantrasyonlarda anti-proliferatif etkilerini göstermesi ile en etkili türevler olduğunu göstermiştir. Hücre döngüsü ve hücre ölümü mekanizmalarının araştırılması ile 42 ve 52 bileşiklerinin G2/M fazında areste ve apoptotik hücre ölümüne sebep olduğu ortaya çıkmıştır. Buna ek olarak, bileşikler iler muamele sonucunda p21, CDK1 ve fosforile-CyclinB1 gibi hücre döngüsünde yer alan proteinlerin seviyelerinin azaldığı gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: Hepatoselüler karsinom, PI3K/Akt/mTOR sinyal yolağı, Sorafenib, karaciğer kanseri kök hücresi, ilaç direnci, VEGFR2 TK inhibitörleri, quinoid, pirazolik kalkon türevleri, biyoaktivite, hücre döngüsü, apoptoz