PID-PC'lerden izole edilen eksozomların pankreas kanseri üzeine etkisi

Pankreas ekzokrin ve endokrin salgı yapan iki kısımdan oluşur. Ekzokrin pankreas asinar ve kanal hücrelerinden oluşurken, endokrin pankreas beş farklı hücre tipine sahip Langerhans adacıklarından oluşur. Pankreas kanseri en ölümcül malign neoplazmalardan biridir ve kanser ölümlerinin önde gelen nedenlerindendir. Yıllık sağ kalım oranı %5'ten az olan pankreas kanserin de semptomların ileri evrede ortaya çıkmasından ve ayırt edici olmamasından dolayı tanısında geç kalınmaktadır. Kök hücreler kendi kendini yenileme, klonalite ve farklılaşma yeteneğine sahip embriyonik ve fetal dönemlerinde doku ve organların oluşumunda rol oynayan, yetişkin dönemlerinde ise hasar onarımda etkili olan farklılaşmamış hücrelerdir. Yetişkin dönem kök hücrelerinden biri olan mezenkimal kök hücreler antiinflamatuar, immünoregülatör ve immünosupresif kapasiteye sahiptirler. Pankreatik ada türevli progenitör hücreler (PID-PC) ise tipik bir mezankimal kök hücre özelliğine sahiptir. Eksozomlar 50-150 nm çapında, lipit çift katman ile kaplı veziküllerdir. Hücreler arası etkileşimde etkili olan bu vezikülleri diğer veziküllerden ayıran ve onları önemli kılan taşıdıkları RNA kargolarıdır. Salgılandıkları hücrelerden miRNA ve mRNA taşıyarak hedef hücrede değişikliğe sebep olabilmeleri, kanser dahil birçok farklı hastalığın tanı ve tedavisinde eksozomların rol alabileceğini düşündürmektedir. Çalışmamızın amacı PID-PC, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre soylarından izole edilen eksozomları karakterize etmek ve ilk defa karşılaştırılmalı olarak boyut analizi yapmaktır. Ayrıca, çalışmanın ikinci amacı olarak, ilk defa PID-PC'lerden izole ettiğimiz eksozomların insülinoma beta hücre tümörü olan INS-1 ve pankreas kanseri olan MiaPaca-2 hücre soyları üzerindeki etkisini araştırmaktır. PID-PC'LERDEN İZOLE EDİLEN EKSOZOMLARIN PANKREAS KANSERİ ÜZERİNE ETKİSİ xvi Eksozomlar her üç hücre soyundan eksozom izolasyon kitleri ile izole edilmiştir. Hem izole edilen eksozomlar da hem de her üç hücre soyundan elde edilen lizatlarda eksozom belirteci olarak bilinen Alix, TSG101, CD9 ve CD81 proteinleri Simple Wes ile analiz edilmiştir. Üç farklı hücre soyundan elde edilen eksozomların boyutları ve konsantrasyonları Nano Partikül İzleme Analizi (NTA) ile belirlenmiştir. Karakterize edilen PID-PC'lerden izole edilen eksozomlar 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5 ve 10 µg/ml konsantrasyonlarda hem INS-1 hem de MiaPaCa-2 hücre soylarına 24 ve 72 saat uygulandıktan sonra hücre canlılık testi (MTT) yapılmıştır ve IC50 değerleri belirlenmiştir. Belirlenen IC50 değerlerindeki eksozomlar INS-1 ve MiaPaca-2 hücre soylarına 72 saat uygulandıktan sonra hücreler fikse edilip immünohistokimyasal olarak HSP90, HSF-1, Nestin, Endoglin, Kaspaz-8, Aktif Kaspaz-3, Beclin ve p-Bcl-2 antikorları ile işaretlenmiştir. Işık mikroskobunda bilgisayar destekli görüntü analiz programı NIS-Element D 3.1 programı kullanılarak proteinlerin işaretlenme yoğunlukları hesaplanmıştır. Belirlenen IC50 değerindeki eksozomlar MiaPaca-2 hücre soyuna 72 saat uygulandıktan sonra LDH kiti ile hücre sitotoksisitesi ölçülmüştür. Ayrıca eksozomun INS-1 hücre soyunda fonksiyonel olarak etkisini araştırmak için belirlenen IC50 değerindeki eksozomlar 72 saat INS-1 hücrelerine uygulandıktan sonra hücre sekresyonu toplanmış ve hücre lizatı elde edilmiştir. Elde edilen hücre lizatında ve sekresyonunda İnsülin ELİSA kiti ile insülin seviyelerine bakılmıştır. Simple Wes analizlerine göre PID-PC, Miapaca-2 ve INS-1 hücre soylarından izole edilen eksozomlarda, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre lizatlarında Alix proteini tespit edilmiştir. TSG101 proteini PID-PC, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre lizatlarında bulunurken, izole edilen eksozomlarında görülmemiştir. CD9 proteini PID-PC, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre lizatlarında ve INS-1 hücre soyundan elde edilen eksozomlarda gözlemlenmiştir. CD81 proteini ise sadece MiaPaca-2 hücre soyundan elde edilen lizatta çok az miktarda görülmüştür. NTA sonuçlarına göre PID-PC'lerden izole edilen eksozomların 103.6 ± 28.6 nm, MiaPaca-2 hücre soyundan izole edilen eksozomların 100.7 ± 10 nm, INS-1 hücre soyundan izole edilen eksozomların 147.2 ± 12.3 nm olarak boyutları analiz edildi. Hücre canlılık analizine göre, PID-PC'lerden izole edilen eksozomlar ile MiaPaca-2 hücreleri 24 saat inkübe edilmesi sonucu düşük konsantrasyonlardaki eksozom uygulaması sonucu hücre canlılığında anlamlı bir değişiklik olmamaktadır. MiaPaca-2 hücrelerinin 72 saat izole edilen eksozomlar ile inkübasyonu sonucu düşük dozlardan itibaren hücre canlılığında anlamlı bir azalma meydana gelmektedir. INS-1 hücre soyunun ise eksozom ile 24 saat inkübe edilmesi sonucu 5 µg/ml konsantrasyonda eksozom uygulamasına kadar hücre canlılığında kontrole kıyasla farklılık görülmemiştir. INS-1 hücrelerinin eksozomlar ile 72 saat inkübe edilmesi sonucunda 2,5 µg/ml konsantrasyonda eksozom uygulamasına kadar değişiklik gözlenmezken, ileri dozlarda eksozom uygulaması sonucu hücre canlılığı anlamlı bir şekilde azalmaya başlamıştır. İmmünohistokimyasal işaretlenme sonuçlarına göre, INS-1 hücre soyuna eksozom uygulandığında HSP90 immünboyama yoğunluğu kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlılık göstermezken, eksozom uygulanan MiaPaca-2 hücre soyunda HSP90'nın immünboyama yoğunluğu kontrol grubuna göre anlamlı derecede artmıştır. Ayrıca her iki hücre soyunun da eksozom uygulanan gruplarında MiaPaca-2 hücre soyunun HSP90 immünboyama yoğunluğu INS-1 hücre soyuna göre anlamlı derecede yüksektir. HSF-1 immünboyama yoğunluğunda eksozom uygulanan INS-1 ve MiaPaca-2 hücre soylarında kendi kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlılık yokken, MiaPaca-2 hücre soyunun kontrol grubunun INS-1 hücre soyunun kontrol grubuna göre ve eksozom uygulanan MiaPaca-2 hücre xvii soyunun eksozom uygulanan INS-1 hücre soyuna göre HSF-1 immünboyama yoğunlukları anlamlı derecede fazladır. Eksozom uygulanan ve uygulanmayan INS-1 ve MiaPaca-2 hücre soylarında Nestin ve Endoglin immünboyama yoğunluğunda anlamlı bir farklılık yoktur. Nestin'in immünboyanması sonucunda, her iki hücre soyunun kontrol grubunda Nestin proteinine ait hiç işaretlenme yoktur. Benzer bir şekilde Endoglin'in immünboyanması sonucunda, INS-1 hücre soyunun hem kontrol grubunda hem de eksozom uygulanan grubunda, MiaPaca-2 hücre soyunda ise sadece kontrol grubunda Endoglin proteinine ait hiç işaretlenme olmamıştır. Miapaca-2 hücre soyunda Kaspaz-8 ve Aktif Kaspaz-3 immünboyama yoğunluklarında eksozom uygulanan grupta kontrol gruba göre farklılık görülmemiştir. Beclin ve p-Bcl-2 immünboyama yoğunluklarında eksozom uygulanan MiaPaca-2 hücre soyunda kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir azalma vardır. MiaPaca-2 hücre soyuna eksozom uygulaması sonrasında MiaPaca-2 hücre soyundan salınan LDH seviyesi %13,98 ± 3,361 olarak analiz edilmiş ve hücre sitotoksititesi belirlenmiştir. Eksozom uygulanan INS-1 hücrelerine ait hücre sekresyonu ve lizatında ELİSA kiti ile ölçülen insülin seviyelerine göre hücre lizatlarında insülin seviyesi kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede artmıştır. Ancak hücre sekresyonunda insülin seviyesi kontrol gruba göre farklılık göstermemiştir. Ayrıca eksozom uygulanan INS-1 hücre lizatlarında insülin seviyesi hücre sekresyonuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir derecede artış göstermiştir. Sonuç olarak, PID-PC, MiPaca-2 ve INS-1 hücre soylarından ilk defa tarafımızca izole edilen ve boyut analizi gerçekleştirilen eksozomların literatürde yer alan farklı kaynaklardan izole edilen eksozom boyutlarına göre benzer olduğunu gördük. Alix proteininin üç hücre soyundan izole edilen eksozomlar için ve CD9 proteininin sadece INS-1'den izole edilen eksozomlar için spesifik bir belirteç olabileceğini gözlemledik. PID-PC soyundan izole edilen eksozomların MiaPaca-2 hücrelerini zamana ve doza bağlı olarak hücre ölümüne götürdüğünü hücre canlılık analizinde tespit ettik. Bunun yanı sıra MiaPaca-2 hücreleri için belirlenen IC50 değerinin pankreatik beta hücrelerini en iyi şekilde taklit eden ve bazı çalışmalarda sağlıklı pankreatik beta hücreleri yerine de kullanılabilen INS-1 hücrelerinde hücre canlılığı üzerine etkili olmaması, izole edilen eksozomların sağlıklı hücrelere zarar vermeden kanser hücrelerini öldürebileceğini düşündürmektedir. İmmünboyama sonucunda MiaPaca-2 hücre soyunda HSP90'nın anlamlı bir şekilde artışı, pankreas kanserinde olası eksozom ile tedavi durumunda bu proteinin artışının bir belirteç olabileceğini düşündürmektedir. p-Bcl-2 seviyesinin MiaPaca 2 hücre soyunda anlamlı azalışı hücrelerin apoptotik yolla ölebileceğini gösterirken, Aktif Kaspaz-3 seviyesinde anlamlı bir değişiklik olmaması apoptotik hücre ölümünün çok fazla olmadığını göstermektedir. Beclin-1'deki anlamlı azalış hücrelerin otofojik yolla ölmeyebileceğini gösterirken, MiaPaca-2 hücrelerinde ölçülen LDH seviyesi ile ölen hücrelerin bir kısmının da nekroz ile öldüğünü göstermektedir. INS-1 hücrelerinde eksozom uygulaması sonrası insülin seviyesinin anlamlı bir şekilde artması eksozomların insülin mekanizmasına etki ederek üretimini artıdığını gösterirken, insülin sekresyonunda bir değişiklik olmaması eksozomların insülin salınımına etki etmediğini ya da fazla üretilen insülinin salınımı sırasında sorunlar olabileceğini göstermektedir.