Proteozom inhibitörü bortezomib ve topoizomeraz inhibitörleri camptothesin ve etoposidin myeloid lösemi hücre hatlarında nf-κb sinyal yolağı ve apoptozis üzerine etkilerinin araştırılması

Nükleer faktör kappa B (NF-κB) tümör oluşumu ile doğrudan ilişkili olan hücre proliferasyonu, apoptozis, anjiogenez ve metastazın yanında, bağışıklık sistemi ve inflamasyon gibi birçok önemli olayda rol alan 500'den fazla genin regülasyonunu uyaran bir transkripsiyon faktörüdür. NF-κB'nin hematolojik malignitelerin nerdeyse tamamında ve birçok solid tümörde daimi olarak aktif olduğu gösterilmiştir. Bu durum NF-κB sinyal yolağını bloke eden ajanları kanser terapi için iyi bir hedef haline getirir. Ancak NF-κB sinyal yolağını bloke eden ajanların tümür gelişiminde rol alan mekanizmaları baskılamasının yanında inflamasyon ve bağışıklık sistemi gibi mekanizmaları da inhibe etmesi istenilmeyen bir durum olduğu için kombine terapilerin geliştirilmesi gerekmektedir. Bu tez çalışmasında; klinikteki etkinlikleri proteozomu inhibe etmek olan Bortezomib (Bort), topoizomeraz I inhibitörü olan Camptothesin (CPT) ve topoizomeraz II inhibitörü olan Etoposid (Eto) ilaçlarının tek başına ve kombine uygulamalarının kronik myeloid lösemi (K562) ve akut premyeloitik lösemi (HL-60) hücre hatlarında etkin bir kemoterapötik rejim oluşturup oluşturmadığı, Bort'in DNA'da hasar yapıp yapmadı ve buna ek olarak; topoizomeraz inhibitörlerinin NF-κB sinyal yolağını aktive edip etmediğini bulmak ve bu mekanizmaların apoptozisle olan ilişkisini moleküler düzeyde saptamak amaçlanmıştır. Bu amaçlara ulaşmak için öncelikle tek başına ve ikili ilaç kombinasyonları uygulanan hücre örneklerine MTT test kullanılarak hücre canlılıkları saptanmıştır. Real time RT-PCR yöntemi ile apoptozis, DNA hasarı ve NF-κB sinyal yolağı arasındaki ilişki gen düzeyinde araştırılmıştır. Bu ilişkiyi saptamak için NF-κB1 (p50), Rel-A (p65), ATM, ATR, p53 genlerinin ve apotozis için anti-apoptotik Bcl-2, pro-apoptotik Bax ve Kaspas-3 genlerinin mRNA düzeyindeki değişimler 2-∆∆Ct yöntemi kullanılarak saptanmıştır. Sonuç olarak, Bort, CPT ve Eto'in tek başına her iki hücre hattında da doz bağımlı olarak hücre canlılığını azalttığını ve apoptozise neden olduğunu gözlemledik. Ayrıca, Bort'in her iki hücre hattında da ATM, ATR ve p53 genlerinin mRNA düzeyinde kontrole göre anlamlı bir artışa neden olduğunu bulduk. Bu durum Bort'in bilinen NF-κB inhibisyonu yanında DNA'da da hasar yaparak apoptozise neden olabileceğini gösterdi. Buna ek olarak; Bort'in K562 ve HL-60 hücrelerinde Rel-A gen ifadesindeki artışa bağlı olarak NF-κB sinyal yolağını tamamen inhibe etmek yerine NF-κB'nin pro-apoptotik fonksiyonunu açığa çıkardığı bulundu. Çalışmamızda Eto ve CPT'in DNA'da hasar yaptığını ve ayrıca Eto ve CPT'nin, Rel-A ve NF-κB1 gen ifade düzeylerinde anlamlı bir artışa neden olarak NF-κB sinyal yolağının aktive edebileceğini bulduk. Bort, Eto ve CPT'in birlikte kullanıldığı ilaç kombinasyonları her iki hücrede de sitotoksik etkinin artmasına neden oldu. Hücre canlılığı deneyleri K562 hücrelerinin (%0-20 ye kadar düşen canlılık ile) HL-60 hücrelerine göre kombine terapiye daha iyi cevap verdiğini gösterdi. Tüm ikili kombinasyonların her iki hücre hattında da Bcl-2'de azalma, Bax ve Kaspaz 3 genlerinin ifadesinde artışa neden olması kombine terapinin apoptozise yol açtığını doğruladı ve her iki hücre hattında da Rel-A gen ifadesinde kontrole göre anlamlı bir artışa neden olduğu bulundu. Bu sonuç tüm kombinasyonlarının Rel-A bağımlı NF-κB sinyal yolağına etki ettiğini ve sonuçta Rel-A'nın NF-κB sinyal yolağının pro-apoptotik mekanizmasını tetiklemede elzem olduğu fikrini ileri sürmektedir. Anahtar Kelimeler: NF-κB, Apoptozis, DNA Hasarı, Bortezomib, Etoposid, Camptothesin, qRT-PCR