In silico characterization of mate and IAAL in Pseudomonas syringae and Pseudomonas savastanoi

Pseudomonas cinsinden (genusten) üç bakteri türü vardır: Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 ve Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi hastalığa neden olan ajanlar olarak tanınmıştır. Son analizler, matE ve iaaL genlerinin ve karşılık gelen MatE ve IaaL proteinlerinin virülans ve hastalık oluşumu üzerinde yüksek bir korelasyon ve etkisini göstermektedir. Bu genler ve proteinler, bakterilerin virülans faktörlerinin bitki hücresine iletilmesinden sorumlu olan Tip 3 Salgı Sistemi bakteri makinesinin bir parçasıdır ve bitkideki hastalık sürecinde rol oynayan oksin hormonu üretimi ile bağlantılıdır. Oksin hormonu, hücresel düzeyde organ gelişiminde ve tüm bitki işleyişinden bitki büyüme ve gelişmesine kadar rol oynar. Gövdelerde hücre büyümesi ve uzamasının düzenlenmesinde, hücre bölünmesinde ve farklılaşmasında, meyve gelişiminde, kök oluşumunda ve yaprak dökümünde (dökülmede) görev alır [@Kunkel2018]. Oksin olmadan bitkiler büyüyemez ve gelişemez. Aynı şekilde yüksek miktarda oksin, bitki için ölümcül olabilir. Bakteriler de hayatta kalabilmek için gerekli olan oksinleri üretirler. Birkaç farklı oksin türü vardır. Bitki ve bakteriler tarafından üretilen en yaygın tür indol-3-asetik asittir (IAA). IAA, bakteriyel toksisite ve ilaç savunması ile ilgilidir. IAA ayrıca toksinlerin bakteriyel atılımını destekler, çoklu ilaç ihracatçı genlerin ekspresyonunu tetikler ve plazmit kopyalarının korunmasına katkıda bulunur. Ayrıca IAA, bakterilerde metabolik kontrolde aktif bir sinyal görevi görür. IAA sentezinin öncüsü olan indol, amino asit metabolizmasında yer alan genleri aktive edebilir, ancak bunun tam etki mekanizması bilinmemektedir [@Hu_2010]. Bitkideki oksin miktarı yükseldiğinde oksin, bitkinin hastalık gelişiminde bir virülans faktörü olarak karakterize edilir. Bakteriler bitkilerle etkileşime girerek ve onların oksin miktarını değiştirerek herhangi bir normal oksin sürecine müdahale etme potansiyeline sahiptir. Eksojen oksinin bitki gelişimi üzerindeki etkisi, pozitif etkiden negatife değişir. Bitki için sonuç genellikle (1) bitki için mevcut üretilen IAA miktarının ve (2) bitki dokusunun IAA konsantrasyonundaki değişikliklere duyarlılığının bir fonksiyonudur [@Spaepen2007]. Bu nedenle, enfeksiyon sırasında bitkide tüm farklı süreçler meydana gelir ve kaçınılmaz olarak bitki IAA biyosentez mekanizmasının gerçekleşme şeklini değiştirir. Bakteriler tarafından üretilen oksinin bitki hücrelerine mi girdiği yoksa bakterilerin bitkideki oksin üretimini toksik düzeye kadar uyarıp uyarmadığı hususu henüz bilinmemektedir [@Zhao_2010]. Bir bitkiyi kolonize etmek için bakteriler, bitki hücre zarı boyunca efektör moleküller ve virülans faktörleri iletmek için bir taşıma sistemi kullanır. Taşıma sistemi bakteri kullanımı Tip 3 Salgı Sistemidir (T3SS), matE ve iaaL genlerinin bulunduğu aynı operon olan HrpL operonundan kodlanır. matE geni, T3SS mekanizmasının bir parçası olan MatE proteinini kodlar ve iaaL geni, IAA'nın sentezinde rol oynar. Bu şekilde, IAA, T3SS, MatE proteinleri ve genler arasındaki ilişki kurulabilir ve genel olarak bakterilerin domates ve kivi üzerindeki toksisitesini etkiler. MatE proteini, efektör moleküllerin bakterinin iç zarından geçiş mekanizmasının iğne ve pilusuna geçişini sağlayan membran taşıma mekanizmasının ana parçalarından biridir. Pseudomonas syringae pv. actinidiae'nin MatE proteininin karakterizasyonu, alanları, etkileşim bölgesi, öngörülen protein 3D modeli ve diğer analizlerin yanı sıra promotör ve intergenik dizilerin analizi, proteinin toksisite indüksiyonundaki olası rolünü belirlememize yardımcı olmuştur. BLAST aracıyla, ilgili üç MatE ve üç IaaL proteininin tam dizilerini ve bu proteinlerle diğer organizmalardan tüm homolog dizileri elde ettik. Tam protein dizileri, bulduğumuz ilk diziler eksik ve dolayısıyla alakasız olduğundan araştırmamızın anahtarıydı. MatE proteininin Archaea ve Eukarya gibi farklı türlerde de bulunduğunu görmek ilginçti. IaaL proteini için aynı arama sonuçlarını aldık. Çoklu dizi hizalaması (MSA), analiz ettiğimiz proteinler arasındaki kalıntı polimorfizm bölgelerini ve mutasyonları gösterdi. Sonuçlar bize proteinler arasındaki benzersiz kalıntı farklarını gösterdi, bu da aynı olmayan dizilerle çalıştığımızın kanıtıydı. Organizmalar ve türler arasındaki koruma düzeyi yüksekti, ancak %100 değildi. MSA, üç farklı sunucu tarafından yapıldı ve elde ettiğimiz sonuçlar aynıydı. Filogenetik ağaç, MSA sonuçlarını gösteren, analiz edilen proteinlerin mesafesini gösterir. Filogenetik ağaç, MatE proteinlerini evrimsel mesafeye göre üç gruba ayırdı. Odak noktamız P. syringae pv. actinidiae'nin Mat proteiniydi ve farklı organizmalardan üç MatE proteininin 3D protein modellerini yapmaya karar verdik. Dizileri karşılaştırmak için filogenetik ağaç tarafından ayrılan gruplardan dallanma mesafelerine göre üç protein seçtik. Pseudomonas syringae pv. actinidiae'nin MatE proteininin 3 boyutlu yapısı, protein model yapısının en olası şeklini sergiledi. İki farklı sunucu tarafından bir 3D model yaptık ve her iki sunucuda mevcut en iyi şablon Vibrio cholerae'dandı. Bu şablon, proteinimizle yalnızca %21 özdeşlik eşleşmesine sahiptir, ancak veri bankasındaki mevcut en iyi şablondu. Bu analiz sayesinde, ek araştırmalara ve daha iyi şablon bankalarına büyük ihtiyaç olduğunu gördük. Elde ettiğimiz sonuçlar %100 doğru modelin temsili olamaz, ancak bu araştırmada elde edebileceğimiz en yakın model yapılardır. Yaptığımız 3D model, döngülerle birbirine bağlanan alfa sarmallara ve tüp benzeri bir yapıya sahiptir. MatE proteininde beta zinciri yoktur. QMEAN değeri, değerli veri aralığında ve kapsama alanı yüksek, %95'ten fazla. P. syringae pv. tomato DC3000 ve P. savastanoi pv. savastanoi'den elde edilen MatE proteinlerinin 3D modelleri, tüp benzeri yapıdaki halkalarla birbirine bağlanan sarmallardan yapılmış, görsel olarak benzer bir protein şekline sahipti. P. savastanoi modeli tahmin edildiğinden ve AlphaFold Protein Veritabanında mevcut olduğundan, bize değerli bilgiler ve ilgilendiğimiz proteini onunla ilişkilendirme şansı verir. Yapılar oldukça benzerdir, bu nedenle genel işlev ve etki arasındaki paralellik de çizilebilir. Döngü bölgelerinde bu üç MatE proteininin ikincil yapılarında ilginç değişiklikler bulduk. Bu üç protein karşılaştırıldığında ilmek bölgelerinde polimorfizmler, mutasyonlar ve delesyonlar mevcuttur. Bu önemlidir çünkü ilmek bölgeleri sarmallar kadar sabit değildir, bu nedenle ilmek kalıntı yapısındaki değişiklikler protein katlanma modelini, protein etkileşimini ve genel davranışı etkileyebilir. Proteinin katlanma ve etkileşime girme yeteneği veya komple taşıma makinesinin faaliyetini artırma yeteneği bu şekilde etkilenebilir. Bu nedenle, bulduğumuz değişiklikler {@fig:R19.3}, {@fig:R19.4} ve {@fig:R19.5}'da kırmızı ile çevrelenmiştir. Ayrıca, protein alanlarını belirlemek önemliydi. Bu işlevsel birimler, proteinin genel işlevini belirleyebilir ve organizmalar arasında korunduğu tespit edilirse, ilgilendiğimiz proteinin hastalık gelişimindeki tam işlevini ve etkisini gösterebilir. İki farklı araç tarafından tanımlanan iki "MatE" alanı bulduk. Etki alanları 200 kalıntıdan daha kısaydı. Her üç Pseudomonas türünde de aynı alanlar bulundu ve {@fig:R24}'de grafiksel olarak sunuldu. Proteinlerin etkileşen bölgeleri, proteini aktive edebilen/deaktive edebilen veya onu birçok başka şekilde etkileyebilen ligandlarla protein etkileşiminin açık bölgeleridir. İlgilendiğimiz MatE proteinimiz ile etkileşime girdiğini tespit ettiğimiz "OLC" ligandı, birkaç zincire ve basit bir yapıya sahiptir. Ek ligand bulunamadı. Bu ligand, MatE proteininin tüp benzeri yapı oluşumunun iç kısmına bağlanır. MatE proteininin yalnızca bir etkileşimli ligandı olmasına rağmen, genel protein etkileşimlerini kontrol etmemiz gerekiyordu. STRING etkileşim veritabanlarına göre, P. syringae pv. actinidiae'nin MatE proteini, yalnızca iki protein, IaaL ve P. syringae pv. tomato DC3000'den dış zar porin proteini ile etkileşime girer. Aynı zamanda, IaaL proteini, geniş bir etkileşimli protein ağına sahiptir. Nedeni bu iki proteinin pozisyonu olabilir. MatE proteini, hücre zarına tamamen gömülü olan iç zar proteini olarak öne çıkarken, IaaL sitoplazmik bir proteindir. Bu nedenle, IaaL proteini çok çeşitli çevreleyen proteinlere ve diğer proteinlerle etkileşime girebileceği hücreler arası boşluğa sahiptir. Hücre altı yerelleştirme analizi iki farklı sunucu tarafından gerçekleştirilir. Daha farklı türler arasındaki ve MatE ve IaaL proteini için olan filogenetik ağaç, analiz ettiğimiz proteinlerin benzersiz yapısına ve aralarındaki büyük farklılıklara ilişkin bulgularımızı tasvir etti. Analizde ek kontroller olarak ve MatE proteininin türler arasında korunup korunmadığını görmek için dış grup organizmaları kullanıldı. MatE proteini diğer türlerde de bulunabilse de, hastalığa neden olan ana ajan olduğu için asıl odak noktamız bakterilerdi. Son analizimiz proteinler değil, matE ve iaaL gen dizileri üzerindeydi. Protein analizi ile tanımlayamadığımız nükleotid seviyesinde bazı ek farklılıklar olup olmadığını kontrol etmemiz gerekti. İlk olarak, Pseudomonas türlerinin çoklu organizmaları için intergenik bölgeyi kontrol ettik. Sonuçlar, bu bölgenin polimorfizmler, boşluklar veya mutasyonlar olmadan yüksek oranda korunduğunu gösterdi. Dizinin intergenik kısmı stabildir ve farklı organizmalarda aynıdır. Öte yandan matE ve iaaL genlerinin promotör bölgesinde polimorfizmler bulduk. Bazı organizmalarda promotör bölgesinin nükleotid yapısındaki değişiklikler, arttırılmış veya baskılanmış promotör aktivitesinin nedeni olabilir. Bu özellikle önemli olabilir, çünkü iaaL ve matE genlerinin aynı promotörden kopyalandığını ve bunlardan biri baskılandığında diğerinin de etkin olmadığını biliyoruz. Elde ettiğimiz sonuçları düzenleyerek ve MatE proteininin karakterizasyonuna ve Pseudomonas syringae pv. actinidiae'nin domates ve kivi üzerindeki toksisitesindeki olası rolüne ilişkin araştırmanın amacını yansıtarak, aşağıdaki sonuç açıklamalarına sahibiz. İlk varsayımımız, MatE proteinlerinin farklı olacağı ve toksisitedeki rollerinin deşifre edilmesinin tam protein yapısına dayanabileceği idi. Bu varsayım, aldığımız sonuçlardan dolayı eksik ve yanlış gösterildi. Türler arasındaki MatE proteinlerinin dizileri oldukça benzerdir ve belirli bir dereceye kadar korunur, ancak dizideki polimorfizmler, türler arasındaki benzersiz özelliklerin ve filogenetik çeşitliliğin açık işaretleridir. Ayrıca, promotör bölgesindeki ve özellikle P. syringae pv. actinidiae'nin MatE proteininin halka bölgelerindeki farklılıklar, protein işleyişindeki olası varyansı gösterir ve enfeksiyon sürecinde virülans faktörlerinin taşınmasını etkiler. MatE proteini hücrenin iç zarına gömülü olduğundan, güçlendirici moleküller ve etkileşime girebileceği enzimler, bulduğumuz polimorfizmler nedeniyle farklı olabilir, bu nedenle bu bakteri ile enfekte olan bitkilerde toksisite derin ve daha yoğun olabilir. MatE proteininin 3D modelini oluşturduğumuz şablon protein, sorgu dizimizle yalnızca %21 aynı olsa da, model olarak elde ettiğimiz şekil, diğer proteinlerin tahmin edilen modellerine görsel olarak oldukça benzer. Bu nedenle, tahmin edilen modelimizin analizine güvenebiliriz. Halkalarla birbirine bağlanan ve tüp benzeri bir biçimde düzenlenen alfa sarmalları, yapılarındaki değişikliklerin virülans faktörlerinin ve efektörlerin bitki hücresine taşınmasını etkilediğinin güçlü bir göstergesidir. Protein dizisindeki kalıntı yapısındaki farklılıklar, MatE proteininin Pseudomonas syringae pv. actinidiae'deki geni tarafından kodlandığının güçlü bir göstergesidir, bitkilerde toksisite ve enfeksiyon sürecinde önemli bir role sahiptir. Aynı zamanda bu bakteri, domates ve kivide hastalığa neden olan mekanizmada yer alan benzersiz yapısal özelliklerin nihai kanıtının yanı sıra, protein tahmini için şablonlar olarak kristal form üzerinde daha fazla araştırmaya duyulan ihtiyacı göstermektedir.