Servi polenlerinde tanımlanmış alerjenik pektat liyazın biyoteknolojik üretimi

Polen alerjisi dünyada ve ülkemizde insan sağlığını olumsuz etkileyen, ekonomik kayıplara neden olan ciddi bir sağlık sorunudur. Alerjenik polenler çoğunlukla üst solunum yollarını ve gözleri etkilese de astım gibi daha ciddi hastalıkları tetikleyebilir. Bu nedenle polen alerjisinde erken teşhis ve etkin tedavi büyük önem taşır. Son yıllarda tüm alerjik hastalıklar gibi polen alerjisi de hava kirliliği, küresel ısınma, yoğun kentleşme gibi çevresel faktörler nedeniyle dramatik bir şekilde artmıştır. Alerjik rinit ve konjonktivit gibi polen alerjilerinin tanı ve tedavisinde kullanılacak spesifik ve standardize yeni ürünlere acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Rekombinant alerjenler, polen alerjisinin tanı ve tedavisinde umut vaad etmektedir. Ağaç polenleri çok sayıda alerjen protein içerir. Galakturonik asit içeren polisakkarit zincirlerini parçalayan bir enzim olan ve servi (Cupressaceae) polenlerinde bulunduğu bilinen pektat liyaz alerjen proteinlerden biridir. Bu çalışmada, yerel servi (Cupressus sempervirens) poleninde bulunan pektat liyazın (Cup s 1) Escherichia coli'de rekombinant olarak üretimi ile daha sonraki çalışmalarda ve uygulamalarda kullanılacak bir ürün elde edilmesi amaçlanmıştır. Plazmid (pQE-2) üretimi için E. coli DH5α ırkı, rekombinant protein üretimi için ise, E. coli BL21 (DE3) ırkı kullanılmıştır. Servi polenlerinden izole edilen total RNA'dan PZR ile cDNA kütüphanesi oluşturulmuş ve kalıp olarak cDNA'nın kullanıldığı RT-PZR ile histidin etiketli Cup s 1 geni amplifiye edilmiş ve plazmidle ligasyonu sağlanmıştır. pQE-2 plazmidi ve rekombinant plazmid ısı şoku yöntemi ile E.coli'ye aktarılmış ve transformant hücreler koloni PZR ile seçilerek çoğaltılmıştır. Transformant hücreler 1 mM IPTG (izopropiltiyo-β-D-galaktopiranozid) içeren besi ortamında çoğaltılmış, ardından çöktürülmüş ve homojenize edilmiştir. Rekombinant protein nikel afinite kromatografisi ile saflaştırılmış ve jel elektroforeziyle analiz edilmiştir. Saf rekombinant proteinin alerjenitesi Western blot analiziyle doğrulanmıştır. Sonuç olarak tanıda veya immünoterapide kullanılma potansiyeli olan alerjenik servi poleni pektat liyazının biyoteknolojik üretimi başarıyla gerçekleştirilmiştir