Optimization of a translating ribosomal affinity purification method

Yeni teknolojiler, normal ve kanser hücrelerinde çok geniş transkriptom değişiklikleri ortaya çıkardı. Biz de kanser hücrelerinde izoform çeşitliliğinin sonuçlarını anlamakla ilgileniyoruz. Transcript çeşitliliği, Tek iplikli olgunlaşmamış mRNAların alternatif transkripsiyon başlangıç konumu, alternatif uçbirleştirme ve alternatif poliadenilasyonu sonucuunda oluşabilir. Bu izoformların kanser fenotipine nasıl katkı sağlayabileceğini anlamak için, izoformların kodlama potansiyellerini belirlemek gerekmektedir. Bu sebeple, biz burada, kalıcı olarak GFP etiketli Ribozom Protein L10A'yi ifade eden aktif ribozom komplekslerini immunoçöktürerek translasyona uğrayan mesajcı RNA'ları yakalıyoruz. Spesifik olmayan etkileşimleri en aza indirmek için magnetik boncuk konjuge monoklonal anti-GFP VHH tek domainli lama antikoru kullanıyoruz. İmmunoçöktüme sonrası, RNA izole ettik, DNA kirliliğini temizledik, cDNA sentezledik ve RT-qPCR yaptık. Optimize ettiğimiz protokol protein kodlamayan ve protein kodlayan RNAlar ile test edildi. Sonuç olarak, bu protokolün optimizasyonu, ribozomla etkileşen mRNAların bireysel ve/veya yüksek verimli analizine izin vermektedir