5
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Optogenetik uyarımla NF-κB aktivasyonu yapan bir yöntemin MSS'de inflamasyonun primer depresyon patofizyolojisindeki rolünün incelenmesi amacıyla In Vivo koşullar için geliştirilmesi
Nöro- inflamasyonun depresyon üzerindeki etkilerini inceleyen çalışmaların önemli kısıtlılıklarından biri inflamasyonun lipopolisakkarit (LPS) gibi bakteriyel bir endotoksin aracılığı ile tetiklenmesi ve primer depresyonun patofizyolojisi ile uyumlu bir model kullanılmamasıdır. Bu nedenle nöro-inflamasyon ile depresyon arasındaki karmaşık ilişkinin aydınlatılabilmesi için beyinden köken alan nöro-inflamasyon için güvenilir bir model geliştirilmesi gereklidir. Bu gereklilikten hareketle fizyolojik koşullarda stresle tetiklenen inflamatuvar yanıta benzer şekilde beyinden köken alan inflamasyonu tetikleyen in vitro etkinliği gösterilmiş bir sistemin in vivo koşullara adapte edilmesi amacıyla bu tez çalışması gerçekleştirildi. Bunun için optik uyarı ile hücre zarı üzerinde dimerize olan kriptokrom 2 (CRY2PHR) ve "kriptokrom ile etkileşen basit heliks-loop-heliks 1" (CIB1) reseptör sisteminden faydalanıldı. Bu reseptörlerin sitoplazmik bölgelerine eklenen "interferon düzenleyici faktörlerin DNA'ya bağlı aktivatörü" (DAI) moleküllerinin, CRY2PHR / CIB1 dimerizasyonu ile bir araya gelerek interferon düzenleyici faktörleri (IRF) ve NF-κB transkripsiyon faktörlerini aktive etmesi yoluyla beyinden köken alan inflamasyonun uyarılması amaçlandı. CRY2PHR-DAI/ CIB1-DAI kriptokrom reseptörlerini içeren plazmidler tekrarlayan enjeksiyonlarla hipokampusta ifade ettirildi ve sonrasında tekrarlayan optik uyarılar gerçekleştirildi. Optimal inflamasyona yol açacak enjeksiyon ve optik uyarım dozu ve süresinin belirlenmesi amacıyla farklı protokollerle plazmid enjeksiyonları ve optik uyarımlar gerçekleştirildi. Ancak optik uyarım yapılmayan ve plazmid enjekte edilmeyen kontrol gruplarında da hipokampal bölgede mCherry sinyali ile uyumlu yoğun sinyal gözlendi. Bunun plazmidin tekrarlayan enjeksiyonunun yol açtığı doku travması nedeni ile ortaya çıkmış olabileceği, bu sinyal yoğunluğu içinde gerçek sinyalin güvenilir biçimde tayin edilmesinin mümkün olmadığı değerlendirildi. İleride yapılacak çalışmalarda girişimsel işlemlere bağlı travmanın yol açtığı inflamasyonu en düşük düzeye indirebilmek için, beyinde inflamasyonu modellemek için geliştirilecek yöntemlerde tekrarlayan plazmid enjeksiyonları yerine plazmidin virüsler aracılığı ile kalıcı olarak ifade ettirilmesi, virüs enjeksiyonundan 4-6 hafta sonra optik uyarımlara başlanması önerilir.
Dopa yanıtlı distoni fare modelinde kolinerjik sistemin rolü
Distoni, etiyolojisi gibi patofizyolojisi de oldukça heterojen olan bir hastalık grubu olup üçüncü en sık hareket bozukluğudur. Striatal kolinerjik disfonksiyon pek çok genetik ve semptomatik distoni formunda temel patofizyolojik mekanizma olarak rol oynamaktadır. Tedavide antikolinerjik ajanların etkili olması da bu görüşü desteklemektedir. Bununla birlikte, distoninin altında yatan striatal kolinerjik bozukluk çok iyi anlaşılabilmiş değildir. Yakın dönemde Dopamine yanıtlı distoni (DRD) hastalarında görülen tirozin hidroksilaz (TH) geni p.381Q>K (c.1141C>A) mutasyonu "knock-in" yöntemiyle fare genomuna yerleştirilerek oluşturulan DRD fare modelinde, hastalarda görüldüğü gibi genç erişkinlik döneminde, gün içinde kötüleşen, L-DOPA ve yüksek doz antikolinerjik triheksifenidil tedavilerine iyi yanıt veren distoni saptandı. Etiyoloji ve kliniği bir arada taklit edebilme özelliğiyle yapısal, nörokimyasal ve patofizyolojik değişiklikleri çalışmak için ideal olan bu modelde olası striatal kolinerjik sistem değişikliklerinin değerlendirilmesi için öncelikle 3-aylık genç ve 15-aylık yaşlı farelerde striatal kolinerjik internöronların (ChI) sayısı ve fonksiyonel striatal bölgelerdeki dağılımı tarafsız stereolojik sayımlar yapılarak incelendi, sadece 3 aylık DRD fare grubunda, post-komissüral dorsal bölgede kontrollere göre istatistiksel olarak anlamlı sayı artışı bulundu (p < 0,05). Diğer bölgeler için herhangi bir fark saptanmadı, 15-aylık farelerde de toplam sayı ve dağılım yönünden bir fark izlenmedi ve yaşlanma ile birlikte distoni kliniği kaybolduğu halde bunun striatal ChI'ler açısından bir karşılığı olmadığı görüldü. ChI'lerin dendritik ağacının genişliği ve dallanma sayısı Sholl analizi ile değerlendirildi ve DRD farelerde orta ve kaudal striatumda kontrollere göre istatistiksel olarak anlamlı azalma saptandı (p <0,05). Muskarinik reseptörler ile ilgili olası değişiklikler striatal kesitlerde M1 ve M4 immünohistokimyasal işaretleme yapılarak incelendi ancak DRD fareler ile kontroller arasında herhangi bir fark izlenmedi. Distoni patofizyolojisinde rolü olabilecek bir diğer striatal internöron grubu olan parvalbumin pozitif nöronlarda DRD farelerde kontrollere kıyasla sayıca bir değişiklik olmadığı görüldü. Son olarak tirozin hidroksilaz işaretlemesi ile DRD farelerin striatumunda özellikle rostral, orta ve ventral striatumda önemli bir sayı artışı olduğu saptandı. Elektron mikroskopik incelemelerde dorsal striatumda dopaminerjik ve kolinerjik terminallerle ilgili anlamlı bir değişiklik olmadığı izlendi. Sonuç olarak, DRD fare modelinde, striatal ChI'lerin dendritik ağacının genişliğinde ve dallanma sayısında saptanan azalmanın distoni patofizyolojisine ışık tutabilecek önemli bir öncül bulgu olabileceği ve bu bulgunun daha ileri yöntemlerle araştırılması gerektiği düşünülmüştür.
Beyin kökenli nörotrofik faktörün kortikal yayılan depresyonun tetiklediği nöroinflamasyon üzerine etkilerinin araştırılması
Kortikal yayılan depresyon (KYD) deneysel çalışmalar dışında insanlarda migren aurası, iskemik inme, akut beyin travması, intrakraniyal kanama ve epilepsi gibi durumlarda görülmektedir. KYD ile inflamatuar bir yanıt tetiklendiği pek çok çalışma ile ortaya koyulmuştur ve KYD ile ilişkili değişiklikler sağlıklı beyin dokusunda kendiliğinden düzelmektedir. Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF), nöroprotektif ve anti-inflamatuar etkileri olduğu düşünülen bir nörotrofik faktördür. Çoklu KYD'nin neden olduğu inflamatuar cevap ile BDNF arasındaki ilişki tam olarak bilinmemektedir. Bu çalışmada BDNF'nin KYD ile tetiklenen inflamatuar yanıtın azaltılmasında etkili olduğu hipotezini araştırmak amaçlanmış ve öncelikle çoklu KYD sonrası erken dönemde (1., 2. ve 6. saat) BDNF ve proBDNF protein düzeyleri ile inflamatuar sitokinlerden IL-1β ve TNF-'da olan değişimler incelenmiştir. Çoklu KYD sonrası 1. saatte BDNF protein düzeylerinin karşı taraf kortekse göre arttığı, 6. saatte ise hem karşı taraf kortekse hem de yalancı uygulama korteksine göre arttığı bulunmuştur. ProBDNF protein düzeyleri ise hem 1. saatte hem de 6. saatte karşı taraf ve yalancı uygulama korteksine göre artmıştır. İmmünohistokimyasal olarak BDNF proteini ile işaretli hücrelerin çoğunlukla astrosit belirteçleri ile de işaretlendiği görülmüş ve çoklu KYD sonrası BDNF artışının daha çok astrosit kaynaklı olduğu düşünülmüştür. Birinci saatten başlayarak normalde nükleer olarak işaretlenen nöronal IL-1β'nın sitoplazmaya geçtiği, 6. saatte ise nükleer formunun arttığı saptanmıştır. Yine normalde nükleer olarak işaretlenen nöronal TNF- da, çoklu KYD sonrası 2. saatte sitoplazmaya geçerek aktifleşmiş, 6. saatte ise yeniden nükleer işaretlenmesinde artış olmuştur. İkinci olarak intraserebroventriküler (İSV) enjeksiyon yoluyla kortikal BDNF düzeyleri arttırılarak bu artıştan sonraki çoklu KYD ile tetiklenen inflamatuar süreç üzerine etkisi araştırılmıştır. İSV rekombinan BDNF proteini enjeksiyonu yapılan kortekste BDNF protein düzeylerinin yalancı uygulamaya göre arttığı bulunmuş ancak bu artış çoklu KYD sonrası 1. ve 2. saat IL-1β işaretli hücre yüzdeleri açısından anlamlı fark yaratmamıştır. BDNF proteininin bu inflamatuar süreçlere etkisinin incelenmesi için merkezi sinir sistemine girişimsel olmayan şekilde arttırıldığı yöntemlere ihtiyaç olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmada, daha önce anti-inflamatuar etkileri olduğuna ilişkin veriler olan BDNF proteininin çoklu KYD ile arttığının gösterilmiş olması, KYD ile ilişkili inflamasyonda rolü olduğu hipotezini desteklemektedir. Anahtar kelimeler: kortikal yayılan depresyon, beyin kökenli nörotrofik faktör, nöroinflamasyon, interlökin 1 beta, tümör nekrotizan faktör alfa
Eritropoetinin SHSY5Y hücre hattında mikroRNA ekspresyonu üzerine etkisi
Eritropoetin (EPO), eritropoezi uyaran hematopoietik büyüme faktörü ve sitokindir. Son yıllarda beyindeki nöronal ve glial hücrelerde kendisinin ve reseptörünün varlığı ortaya konmuştur. EPO; sinir sisteminin gelişiminde, nöronal canlılığın devamında nöronal hasarın tamirinde kritik roller üstlenir. EPO'nun nöroprotektif etkisinin olası bir mekanizması transkripsiyonel düzeyde gen regülasyonudur. Transkripsiyonel gen regülasyonunda önemli role sahip molekül grubundan birisi mikroRNA'lar (miRNA), küçük, kodlama yapmayan RNA'lardır. Gen ekspresyonunu mRNA parçalanması ya da translasyon inhibisyonu yoluyla düzenlerler. miRNA'ların sinir sisteminin gelişiminde, plastisitesinde, nörodejenerasyonunda rol oynadıkları saptanmıştır. Bu çalışmada amacımız EPO'nun SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattında miRNA ekspresyonunda yaptığı değişikliklerin incelenmesidir. Bu amaçla nöronal bir hücre hattı olan SH-SY5Y hücre hattına EPO indüksiyonu uygulanıp bunun sonucunda ekspresyonu değişen mikroRNA'lar mikroarray ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (kPCR) yöntemleriyle incelenmiştir. EPO uyarımı ile ekspresyonu değişen mikroRNA'ların hedef genleri biyoinformatik analizle saptanmıştır. Araştırmamızın sonuçlarına göre EPO uyarımı ile miR-885-5p, miR-1236, miR-451 miR-640 ve miR-4303 ekspresyon değişimi anlamlı olduğu bulundu. Target analizinde miR-885-5p ve miR-451'in hedef genlerinin EPO'nun etki mekanizmasında rol oynama ihtimali yüksek moleküller olduğu saptandı. Çalışmamız EPO uyarımının nöronal hücrelerde miRNA ekspresyon değişimine neden olduğunu gösteren ilk çalışma olmakla birlikte, ekspresyon değişimi saptanan miRNA'lar için hedef gen analizlerinin doğrulamasının yapılması gereklidir.
Prefrontal kortekste nudt6 ifadesindeki değişikliklerin sıçanda depresyon-benzeri ve anksiyete-benzeri davranışa etkileri
Doğal "antisense" transkriptler çoğunlukla protein kodlayan bir "sense" DNA zincirinin karşı zincirinden sentezlenen ve "sense" mRNA'ya tamamlayıcı olup onun ifadesini düzenleyen mRNA molekülleridir. NUDT6, FGF2'nin doğal "antisense" transkriptidir, FGF2 ifadesinin kontrolünde yer almaktadır. FGF2 antidepresan ve anksiyolitiktir, bu nedenle NUDT6'nın afektif davranıştaki rolü araştırılmalıdır. Laboratuvarımızdaki sıçan çalışmalarında, kronik hareketsiz bırakma stresinin prefrontal kortekste (PFK) NUDT6 ifadesini azalttığı gösterilmiştir. Buna dayanarak, bu çalışmada, sıçan PFK'sında NUDT6 ifadesindeki değişikliklerin depresyon- ve anksiyete-benzeri davranışla ilişkisi incelenmiştir. Prelimbik ve infralimbik kortekslerde AAV2 aracılığıyla NUDT6 fazla ifade ettirilmiş ve ifadesi baskılanmıştır. Depresyon-benzeri davranış sükroz tercihi ve zorla yüzdürme; anksiyete-benzeri davranış yükseltilmiş artı labirenti ve aydınlık-karanlık kutu; öğrenme pasif kaçınma testiyle değerlendirilmiştir ve hayvanlar sakrifiye edilerek PFK'daki moleküler değişiklikler incelenmiştir. PFK'da NUDT6 fazla ifadesinin depresojenik ve anksiyojenik olduğu, ancak ifade baskılamasının davranışta önemli bir değişikliğe yol açmadığı gösterilmiştir. Ek olarak, NUDT6 fazla ifadesinin dürtüsellik-benzeri davranışa etkisi olabileceği gözlenmiştir, bu bağlantı ileri çalışmalarla netleştirilmelidir. NUDT6'nın etkilerine aracılık eden mekanizmaların ortaya konması, depresyonun ve anksiyete bozukluklarının patogenezinin daha iyi anlaşılması için büyük önem taşımaktadır. Anahtar Kelimeler: NUDT6, FGF2, "antisense", depresyon, anksiyete Bu çalışma Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından THD-2016-11687 proje numarası ile desteklenmiştir.