522
Arşivlenen Tez
0
DOI Atanmış
0%
DOI Oranı
Anabilim Dalı
E. coli hücrelerinden polimerik mikrokriyojeller ile RNA saflaştırılması
RNA saflaştırma, yaşam bilimlerini konu alan birçok çalışmada, özellikle viral, bakteriyel ve parazitik hastalıkların teşhisinde, kalıtsal bozuklukların diagnozunda, bir dizi hazırlayıcı ve analitik yöntemin kritik bir ilk aşamasını oluşturmaktadır. Bu bağlamda moleküler biyoloji teknikleri uygulamalarıyla hassas ve güvenilir sonuçlar elde etmek için saf ve bozulmamış halde saflaştırılmış RNA molekülleri gerekmektedir. Afinite kromatografisi, iyonik/hidrofobik etkileşimler, hidrojen bağı, disülfür köprüsü gibi moleküler etkileşimler kullanılarak bir karışımdaki belirli bir molekülün veya bir grup molekülün ayrılması, uzaklaştırılması ve saflaştırılması için kullanılan bir yöntemdir. Afinite kromatografisi; antikorlar, enzimler, hormonlar, DNA, reseptörler ve vitaminler dahil olmak üzere birçok biyomolekülün ayrılması ve saflaştırılması gibi biyokimyasal ve biyoteknolojik süreçlerde sıklıkla kullanılmaktadır. Boronat afinite kromatografisi, cis-diol içeren biyomoleküllerin izolasyonu ve saflaştırılması için kullanılan yaygın bir saflaştırma yöntemidir. Son dönemlerde spesifik afinite etkileşimlerinden yararlanan kromatografik stratejileri giderek geliştirilmektedir. RNA'nın ayrılması için geliştirilen ii etkili tekniklerden yararlanarak boronat afinite kromatografisi, cis-diol grupları içeren çok çeşitli biyomoleküllerin biyoseçici ayrımı ve zenginleştirilmesi için umut verici bir yaklaşımdır. Geleneksel partikül bazlı adsorbanlar farklı ölçeklerde kolonlara eklenebilmeleri sebebiyle kromatografide sıklıkla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, genellikle nispeten küçük gözenek boyutlarına sahiptirler ve yavaş difüzyonlu kütle transferi, düşük akış hızları ve yüksek basınç düşüşü gibi bazı dezavantajlara neden olurlar. Bu nedenle, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için farklı adsorbanlar geliştirilmiştir. En iyi bilinen alternatiflerden biri kriyojel bazlı adsorbanlardır. Kriyojeller, sıfır altı sıcaklıklarda jelleşme yoluyla üretilen makro gözenekli polimerik malzemelerdir. Ek olarak, kriyojeller, orijinal kalıbı ölçülerinde monolitik formda hazırlanır ve genellikle sadece kendi şekline uygun olan belirli bir kolonda kullanılır. Sunulan tez kapsamında, istenen ölçek ve şekilde sentezlenebilen mikron boyutlu kriyojeller, mikrokriyojeller olarak adlandırılmıştır, boronat afinite adsorbanı olarak imal edilmiştir. İki farklı türde sentezlenen PHEMA ve poli(HEMA-VPBA) mikrokriyojeller, SEM, FT-IR, μCT gibi çeşitli yöntemlerle karakterize edildikten sonra kesikli sistemde optimum adsorpsiyon koşullar belirlenmiştir. Yapılan tez çalışmasında, uygun karakterizasyona sahip olması nedeniyle Poli(HEMA-VPBA) mikrokriyojeller kullanılarak optimum koşullar pH 8.5 etilenamin tamponu 0.1 M CaCl2 tuz varlığı 37 oC olarak elde edilmiştir. Sulu çözeltiden RNA adsorpsiyonu deneyleri sonucunda 50. dakikadan sonra adsorpsiyon doygunluğuna ulaşıldığı, 0.5 mg/ml RNA derişiminde maksimum adsorpsiyon kapasitesinin 303 mg/g polimer olduğu bulgusuna erişilmiştir. Adsorpsiyon izotermi inceleme çalışmalarında Langmuir izotermine uygunluk gösterdiği ve ikinci dereceden izoterm kinetiği ile örtüştüğü belirlenmiştir. Mikrokriyojellerin tekrar kullanılabilirlik incelemeleri 8 kez yapılarak sonucunda 223.4 mg/g adsorpsiyon kapasitesi değerine ulaşılmıştır. Tezde, deney ve kontrol kolaylığı sağladığından dolayı biyokimyasal süreçlerde sıklıkla tercih edilen E. coli hücreleri kullanılmış ve E. coli hücrelerinden inkübasyon ve santrifüj işlemleri sonucunda RNA özütü elde edilmiştir. RNA özüt, desorpsiyon ajanı olarak 0.1 M borat tamponu 0.5 M CaCl2 vasıtasıyla yıkanmıştır. Yıkama sonucu agaroz jel elektoforez analizi sonucunda RNA'nın yüksek oranda başarılı şekilde saflaştırıldığı kanıtlanmıştır.
Epilepsi tedavisinde kullanılmak üzere fenitoin yüklü katı lipid nanopartiküllerin sentezi ve karakterizasyonu
Epilepsi dünya nüfusunun %1' ini etkileyen ve spontan tekrarlayan nöbetler ile karakterize kronik bir nörolojik hastalıktır. Yaygın nedenleri arasında kritik nöronal genlerdeki patojenik genetik varyantlar, travmatik beyin hasarları, enfeksiyon ve genetik destekli olan veya olmayan gelişimsel malformasyonlar bulunmaktadır. Epilepsi tedavisinde çeşitli ilaçlar kullanılmakla birlikte bu ilaçlar epilepsiyi tedavi etmemekte sadece nöbet oluşumunu önlemektedir. Bu nedenle epilepsi tedavisin de kullanılan bu tür ilaçlar antikonvülsanlar olarak bilinmektedir. En yaygın kullanılan antikonvülsanlardan biri olan fenitoindir. Fenitoin yüksek oranda protein bağlanma kapasitesine sahiptir ve fenitoin nöbet önleyici etki gösterdiği dozlarda protein bağlanma özelliği, fenitoinnin yan etkisini arttırmaktır. Bu durum nöbet önleme etkisi yüksek olmasına rağmen fenitoinin epilepsi hastalarında kullanımı günümüzde oldukça azalmıştır. Günümüzde konvensiyonel tanımlı terapötiklerin biyoyararlanımlarını artırmak / yan etkilerini azalmak için nanopartiküller taşıyıcı sistemleri ile kombinasyonu çalışılan konulardandır. Nanopartiküllerin sağladığı temel avantajlar; (1) suda çözünürlüğü arttırarak iyileştirilmiş biyoayarlanım, (2) vücuttaki direnç süresini arttırma (klirens için yarı ömrü arttırma/ aynı kökenli reseptörleri için özgüllüğü arttırma) ve (3) ilacı belirli bir bölgeye (etki yeri) hedeflemedir. Böylece gerekli ilaç miktarında ve doz toksisitesinde eş zamanlı azalmaya neden olarak toksik teröpatik ilaçların güvenli bir şekilde verilmesini ve hedef olmayan hücre ve dokuların ciddi yan etkilerden korunmasını sağlamasıdır. Serbest fenitoinin canlı içerisinde proteine tutunarak işlevsizleşmesi, suda çözünmüyor olması ve yüksek dozlarda hastaya verilmesi durumunda önemli yan etkilere sebep olması göz önünde bulundurularak son dönemlerde bu gibi durumların önlenmesi için ilaç taşıyıcı olarak ve kontrollü salım gerçekleştirmek üzere sık kullanılmaya başlanan nanopartiküler sistemler ile fenitoinin yeniden epilepsi tedavisinde kullanılmaya başlanabileceği öngörülmüştür. Bu amaçla sunmuş olduğumuz proje önerisinde stearik asit nanopartiküller içerisine enkapsüle edilen fenitoinin in vitro karakterizasyonu gerçekleştirilecek ve glial ve nöronal hücrelerdeki etkileri incelenecektir. Bu amaçla T98G gliablastoma hücre hattında in vitro epilepsi modeli oluşturulacak ve bu modellerin ilaç yüklü nanopartikül ile etkileşimi sonucu hücrelerde meydana gelen değişimler (TOS ve 8-OHdG) incelenecektir. Anahtar Kelimeler: Epilepsi, Fenitoin, Katı Lipid Nanopartiküller, TOS, 8-OHdG
Yapay zeka yöntemi ile bölütlenmiş karmaşık damar yapılarının üç boyutlu biyoyazıcı ile üretimi
Dünya Sağlık Örgütü'ne göre kalp hastalıkları dünya çapında başlıca ölüm nedenlerinden biridir. Kalp ve koroner hastalıklarının teşhisi ve tedavi planlamasında girişimsel bir medikal görüntüleme yöntemi olan ve çok detaylı görüntüler elde edilebilen Bilgisayarlı Tomografi Anjiyografi (BTA) kullanılmaktadır. Bilgisayarlı Tomografi Anjiyografi görüntüleri üzerinden koroner arterleri incelemek için bir dizi bilgisayarlı görü ve tanı destek sistemlerine ihtiyaç bulunmaktadır. Tez çalışması kapsamında, koroner arterlerin yapay zeka ile bölütlenmesi ve bölütleme sonu elde edilen üç boyutlu (3B) modelin biyobaskılanabilirliği incelenmiştir. Bu kapsamda, halka açık erişimi bulunan koroner arterlerin sınıflandırıldığı CLS12 adlı BTA görüntüleri kullanılarak, derin öğrenme mimari çerçevesi olan nnU-Net içerisindeki 3B U-Net ile eğitim gerçekleştirilmiştir. Üç boyutlu karmaşık koroner arter damar bölütlemesi tam otomatik olarak U-Net, MultiRes U-Net, nnU-Net ve transfer öğrenme ile nnU-net ile gerçekleştirilmiş ve diğerleriyle karşılaştırıldığında transfer öğrenme ile nnU-net eğitimi 0.86 Dice benzerlik katsayısı (DSC) ile daha başarılı bir bölütleme sağlamıştır. Bölütleme sonucu 3B koroner arter modeli başarılı bir şekilde elde edilmiş ve '.stl' formatında kaydedilerek 3B biyoyazıcıyla kullanılabilir hale getirilmiştir. Tezin ikinci kısmında, yapay zeka yöntemiyle oluşturulmuş 3B koroner arter modelinin biyobaskılanması için ticari olarak satılan ve eriyik biriktirme yöntemiyle çalışan bir 3B yazıcı, açık kaynaklı donanım ve yazılım araçları kullanılarak düşük maliyetle bir 3B biyoyazıcıya dönüştürülmüştür. Geliştirilen koroner arter modeli, aljinat biyomürekkebi kullanılarak mikroekstrüzyon presibiyle çalışan 3B biyoyazıcı aracılığıyla Pluronic F-127 destek banyosu içerisine başarılı bir şekilde biyobaskılanmıştır. Çalışmanın devamında 3B biyobaskılanmış damar yapıları, makroskopik görüntüleme, mikro-bilgisayarlı tomografi ($\mu$-BT) ve akış deneyleriyle karakterize edilmiştir. Bu analizlerde biyobaskılanmış damar yapısının içi boş olarak üretilebildiği ve içerisine gönderilen çözelti akışının düzenli ve sızdırmaz olarak gerçekleştiği görülmüştür. Makroskopik ve $\mu$-BT görüntüleme analizlerinde gerçek veri ve yapay zeka sonuçları üzerinden oluşturulan 3B modellerin karşılaştırılması yapılmıştır. Makroskopik görüntüler üzerinden yapılan analizlerde, biyobaskılama öncesinde \%200 olarak ölçeklendirilmiş gerçek 3B damar yapısı için damar çapları farklı bölgelerde 4.3 mm ve 6 mm, yapay zeka çıktısı 3B damar yapısı için ise damar çapları 4 mm ve 5.8 mm olarak ölçülmüştür. Dondurularak kurutulmuş örneklerin $\mu$-BT görüntüleri üzerinden yapılan analizlerde ise, gerçek 3B damar yapısı için farklı bölgelerde dış damar çapları 4 mm ve 5.3 mm ve iç lümen çapı farklı bölgelerde 2 mm ve 1.5 mm, yapay zeka çıktısı 3B damar yapısı için ise dış damar çapları 3.5 mm ve 5 mm ve iç lümen çapı farklı bölgelerde 1.8 mm ve 1.5 mm olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak, bu tez çalışması kapsamında yapay zeka yöntemi ile kişiye özel olarak 3B koroner arter bölütlenmesi kullanıcıdan bağımsız bir şekilde başarıyla gerçekleştirilmiş ve karmaşık yapıların 3B biyoyazıcıyla üretilebilirliği gösterilmiştir. Yapay zeka üzerinden bölütlenmiş 3B koroner arterlerin, mikroekstrüzyon temelli biyoyazıcılar ile doku mühendisliği çalışmalarında başarılı bir şekilde kullanılabileceği gösterilmiştir. Dahası, üç boyutlu biyobaskılama süreçleri yapay zeka ile desteklendiğinde, karmaşık mimarideki diğer doku/organların geliştirilmesi çalışmalarına da yol gösterici olabileceği düşünülmektedir.
İn vitro diyabetik ülser modelinde fotostimülasyonun yara iyileşmesi üzerine etkisinin incelenmesi
Bu çalışma ''İn Vitro Diyabetik Ülser Modelinde Fotostimülasyonun Yara İyileşmesi Üzerine Etkisinin İncelenmesi'' başlıklı Doktora Tez Projesi (FDK-2019-18072) ve ''Fotoaktive Edilmiş Trombositten Zengin Plazma (PRP)'nın Yara İyileşmesi Üzerindeki Etkisinin İncelenmesi'' başlıklı kapsamlı araştırma projesi (FBA-2021-19013) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi (BAP) tarafından desteklenmiştir. Sunulan doktora tez çalışmasında amaç, kronik yara iyileşmesine yönelik olarak PRP (Trombositten Zengin Plazma) ve fotostimülasyonun bir arada kullanıldığı etkin bir tedavi yöntemi geliştirmektir. PRP içeriğinde hücre proliferasyonunu, göçünü ve farklılaşmasını uyaran pek çok büyüme faktörü bulundurmaktadır. Fotostimülasyon ise 600-1200 nm dalga boyundaki ışınları bir arada sunan polikromatik bir ışık kaynağı ile uygulanarak hem trombositlerin aktivasyonu hem de fibroblastların hücresel aktivitelerinin uyarılması sağlanmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında farklı hacimsel oranlara (1:1, 1:3 ve 3:1) sahip kitosan/jelatin doku iskeleleri dondurarak kurutma yöntemi ile üretilmiştir. Üretilen iskeleler genipin (GP) veya EDC/NHS ile çapraz bağlanmış, ardından etanol veya sodyum hidroksit ile nötralizasyon/stabilizasyon işlemi uygulanmıştır. Doku iskelelerinin karakterizasyon aşamasında SEM analizi ile doku iskelelerinin içsel bağlantılara sahip gözenekli bir yapı sergiledikleri belirlenmiş ve gözenek çaplarının yaklaşık 125 μm, gözenekliliğin ise %90 civarında olduğu bulunmuştur. ATR-FTIR analizi ile polimerlerin ve çapraz bağlayıcı ajanların doku iskelelerindeki varlığı kanıtlanmıştır. İnsan kökenli dermal fibroblast hücre (BJ, CRL-2522) hattı ile yürütülen kültür çalışmasında genipin ile çapraz bağlanan CHT/GEL3:1 doku iskelesinin hücresel aktivite açısından en uygun olduğu bulunmuş ve tez kapsamındaki deneylerde bu iskelenin kullanılmasına karar verilmiştir. Hacettepe Üniversitesi Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu 05.05.2020 tarih ve GO 20/372 karar numaralı onayının ardından, gönüllü bireylerden alınan kan ile plateletçe zengin plazma (PRP) izolasyonu kit protokolüne göre gerçekleştirilmiştir. Doku iskelelerine (CHT/GEL3:1), PRP yüklenmiş ardından fibroblast hücreler ekilmiş ve belirlenen optimum koşullarda fotostimülasyon (PAC+) uygulaması yapılarak hem PRP hem de BJ hücreleri aktive edilmiştir. Hücre kültürü çalışmalarının sonuçları dikkate alınarak in vitro koşullarda oluşturulan modelde hücre göçünün etkinliği gösterilmiştir. Çalışmanın son basamağında hiperglisemik ortam ortam koşullarına maruz bırakılan BJ fibroblastları ile 2 ve 3 boyutlu in vitro diyabetik yara (ülser) modelleri oluşturularak hücrelerin yara bölgesinden göçü ışık varlığında ve yokluğunda araştırılmıştır. F-aktin/DAPI boyama ve SEM analizi ile hücre içermeyen bölgelere hücre göçünün gerçekleştiği ve hiperglisemik ortamda ışık varlığında hücrelerin metabolik aktivitelerini sürdürdüğü belirlenmiştir. Tez kapsamında gerçekleştirilen çalışma sonuçları otolog kaynaklı PRP içeren doku iskelelerinin herhangi kimyasal bir ajan kullanılmadan foto-biyouyarım yapılarak başarılı bir şekilde aktifleştirildiğini ve PRP'den uzun süreli olarak salınan yararlı ajanların ve ışığın etkisi ile ortamdaki hücresel aktivitenin hızlandığını göstermiştir. Deneysel bulgular in-vivo deneyler sonrası kronik yaraların tedavisi için klinik açısından önem arz etmektedir.
Böbrek transplantasyonu yapılacak PRA (panel reaktif antikor) pozitif hastalarda HLA haplotipleri ile immünofenotip ilişkisinin araştırılması
İnsan Lökosit Antijeni (HLA- Human Leucocyte Antigen) son derece kompleks bir morfolojiye sahiptir. Bu kompleks yapı, özellikle böbrek gibi bazı organ nakilleri söz konusu olduğunda hasta ve donör arasındaki uyumsuzluğa sebep olan önemli bir faktördür. HLA lokuslarında ne kadar çok uyum varsa rejeksiyon riski ve kullanılacak immünsupresiflerin miktarı o kadar azdır. Panel Reaktif Antikor (PRA) testi ise hastanın serumunda bulunan anti-HLA antikorların tanımlanmasını sağlayan bir testtir. Böbrek bekleme listesindeki hastalarda, hastanın serumunda oluşan anti-HLA antikorlarının varlığı hastada hiper akut ve akut rejeksiyona sebep olmaktadır. PRA pozitif hastaların PRA negatif hastalara göre nakil başarısı daha düşüktür. Bu çalışmada 2012-2022 tarihleri arasında Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim ve Araştırma Hastanesi Doku Tipleme Laboratuvarı'na gelen ve kronik böbrek yetmezliği (KBY) teşhisi konulmuş, çalışma için uygun olan 24 hasta seçilmiştir. T lenfositler böbrek naklinde immün düzenleyici olarak rol alırlar. Antijen sunucu hücrelerle etkileşime giren T lenfositler uyarılır ve sinyal oluştururlar. En önemli sinyal, T hücre reseptörü CD3'ün bir majör histo uyumluluk kompleksi (MHC) ile temasından elde edilir. Bununla birlikte, T hücreleri üzerinde ifade edilen diğer sinyal molekülleri de T hücrelerinin düzenleyici veya effektör hücrelere farklılaşmasını ve aktivasyonunu etkiler. Transplante edilen organın reddinin başlatılması ve sürdürülmesinde aktive edilmiş bu T hücreleri yer alır. Ancak böbrek nakli hastalarının kanında bulunan T lenfosit alt gruplarının ve HLA-DR pozitif hücrelerinin klinik önemi hala belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışmayla 9 PRA pozitif hastanın antikorları belirlenmiştir. Doğal öldürücü hücreler (Natural Killer-NK), T Lenfosit, B lenfosit aktivasyonunun belirlenmesi aşamasında Flow Sitometri cihazı (Beckman Coulter Navios-model, USA) ile HLA-DR, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD25 CD127, CD45, CD57, CD19 belirteçleri kullanılarak lenfosit profili belirlenmiştir. Bu profil hastaların doku tipi ve kendi içinde alt gruplarına göre ayrılarak aradaki fark istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır. PRA pozitif hastalarda sık görülen organ rejeksiyonları ile lenfosit profili arasındaki ilişki SPSS 23 analizi ile sorgulanmıştır. KBY Hastalarının PRA, nakil ve rejeksiyon durumlarına göre aktive CD4+ hücreleri tanımlayan CD4+CD25low ve CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç değerlerinin karşılaştırılması yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar istatiksel olarak incelendiğinde: KBY Hastalarının PRA durumuna göre CD4+CD25low ve CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç ortancaları PRA pozitif hastalarda PRA negatif hastalara göre daha yüksek bulunmuştur (z=4.025; p<0.001; r=0.821). KBY hastalarına ait PRA pozitif hastaların sınıf I ve sınıf II yüzde değerlerinin CD4+CD25low ve CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç değerleri ile karşılaştırılması yapıldığında değişkenler arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır. KBY Hastalarının nakil durumuna göre CD4+CD25low T hücre yüzey belirteç ortancaları nakil olan hastalarda nakil olmayan hastalara göre daha yüksektir (z=2.578, p=0.009, r=0.520). CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç ortancaları için anlamlı bir fark elde edilmemiştir (z=0.550, p=0.608, r=0.110). KBY Hastalarının rejeksiyon durumuna göre CD4+CD25low ve CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç ortancaları rejeksiyon olan hastalarda olmayan hastalara göre daha yüksek saptansa da istatistiksel anlamlı bir değişkenlik göstermemiştir (z=1.776, p=0.095, r=0.562). Hasta sayısı arttırıldığında anlamlı bir fark elde edileceği etki büyüklüğü değerinden (r=0.562; r>0.50 large effect size) anlaşılmaktadır. Hastaların HLA-A, HLA-B ve HLA-DRB1 doku tiplerine ait lokus numaraları ile PRA durumları istatiksel olarak Chi-Square analizi ile incelenmiştir. PRA test sonucu pozitif veya negatif olan hastalarda HLA-A, HLA-B ve HLA-DRB1 lokus numaraları açısından anlamlı bir farklılık gözlemlenmemiştir. Yapılan çalışma kapsamında elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde; KBY hastalarının PRA durumuna göre CD4+CD25low ve CD4+HLA-DR+ T hücre yüzey belirteç değerlerinin hasta monitorizasyonu için ek bir parametre olarak kullanılabileceğini düşündürmüş ancak, hasta sayılarının arttırılarak ve çok değişkenli istatistiksel analiz yapılması gerekmektedir.
Kontrollü bor salan biyobozunur yara örtülerinin geliştirilmesi ve dermal/mukozal rejenerasyonda kullanımlarının araştırılması
Sunulan tez çalışmasında, oral mukoza yaralarının en yaygını olan oral mukozitlerin ve deri yaralarının en yaygını olan ayak ülserlerinin tedavisinde kullanılmak üzere, yara iyileşmesinde terapötik etkilere sahip bor (B) ve nanokil olarak montmorillonit (MMT) içeren fiber matrikslerin geliştirilmesi ve yara iyileşme basamaklarında görev alan keratinosit ve fibroblast hücreleriyle etkileşiminin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Tez çalışmasının ilk aşamasında, terapötik iyonlar arasında yer alan borun farklı derişimlerinin, hücre kültür kaplarında kültüre edilen insan endotel, keratinosit ve fibroblast hücrelerinin davranışları üzerindeki etkileri, yara iyileşmesi açısından değerlendirilmiştir. Sonuçlar, 10 ve 20 μg/mL B derişimlerinde endotel hücrelerinin damar oluşturma kapasitelerinin arttığını, keratinosit ve fibroblast hücre göçünün bir miktar hızlandığını göstermiştir. Aynı zamanda bu bor miktarı, fibroblast hücrelerinin proliferasyonunu da desteklemiştir. Hücre kültür ortamlarına 20 μg/mL'ye kadar eklenen borun, keratinosit ve fibroblast hücrelerinin morfolojisi ve canlılığı üzerine belirgin bir etkisi bulunmamıştır. Çalışmanın 2. aşamasında montmorillonitlere bor adsorpsiyonu gerçekleştirilmiştir. Adsorplanan ortalama B miktarı 2847 μg/g MMT olarak hesaplanmış ve ilk 24 saatte borun yaklaşık %87'sinin salındığı tespit edilmiştir. Üçüncü aşamada, MMT ve B taşıyan MMT (B-MMT) içeren PLGA (poli(laktik-ko-glikolik asit)) fiber matrikslerin elektroeğirme ile üretimi gerçekleştirilmiş ve keratinosit hücrelerinin kültürasyonu yapılmıştır. Fiber matrikslere MMT katkısının gerçekleştirildiği XRD analizi ile gösterilmiştir. Yüzde 20 oranında B-MMT ile katkılanmış PLGA fiber matrikslerin 9 gün boyunca bor salımına devam ettikleri belirlenmiştir. Bununla birlikte, PLGA bazlı fiber matrikslerde ortaya çıkan büzüşme problemi gözenekliliğin azalmasına ve yapının rijit bir hale dönüşmesine yol açarak hücre kültürünün başarısını olumsuz yönde etkilemiştir. Çalışmanın son aşamasında, MMT ve B-MMT katkılı PLA (poli(laktik asit)) bazlı fiber matriksler üretilmiş, karakterizasyon ve hücre kültür çalışmaları yapılmıştır. Farklı miktarlarda B-MMT katkısının fiber matrikslerin morfolojisi, bozunma davranışı ve kimyasal/fiziksel özelliklerine olan etkisi değerlendirilmiştir. Antibakteriyel testler, %10 oranında B-MMT katkılı PLA matrikslerin, gram pozitif bakteri S.aureus suşunda bakterisidal etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Mukoadezyon testi ile, %10 oranında B-MMT içeren PLA fiber matriksin diğer gruplara göre daha mukoadeziv olduğu belirlenmiştir. Keratinosit ve fibroblast hücreleri ile yapılan hücre kültür çalışmalarında, keratinositlerin proliferasyonunun PLA grubunda en yüksek olduğu bulunmuştur. Fibroblast hücrelerinde ise %10 oranında MMT ve B-MMT içeren PLA bazlı fiber matrikslerde en yüksek proliferasyon değerlerine ulaşılmıştır. Canlı/ölü boyama analizleri, her iki hücre tipi için de PLA grubunda ölü hücrelerin daha yoğun olduğunu ortaya koymuştur. Yara iyileşmesi için önemli genlerin ifadeleri RT-PCR ile incelenmiştir. B-MMT katkılı PLA fiber matrikslerde keratinositlerin damarlanma ile ilişkili büyüme faktörlerine ait gen ifadelerinin arttığı, aynı zamanda hücrelerin proliferasyon kapasitelerinin korunduğu belirlenmiştir. B-MMT katkılı PLA fiber matrikslerin fibroblastlar üzerindeki en belirgin etkisi ise, hücre dışı matriks üretimi ile ilişkili genlerin ifadesindeki artış ile ortaya konmuştur. Tüm bu sonuçlardan yola çıkılarak, B-MMT katkılı PLA fiber matrikslerin yara iyileşme yanıtını olumlu yönde etkilediği, böylelikle hem deri hem de oral mukoza rejenerasyonu için terapötik işleve sahip biyoaktif bir yara örtüsü olabileceği değerlendirilmiştir.
Anti-HER2 scFV antikor fragmanının Escherichia coli bakterisinde üretim bölgesinin optimizasyonu
Antikorlar ve antikor fragmentleri, kanser ve viral enfeksiyonlar gibi çeşitli hastalıkların tanısında, görüntülemede ve hedefe özgü tedavilerde kullanılmaktadır. Bulaşıcı hastalıklarla mücadelede de önemli bir yere sahiptir. Esnek bir peptit parçası ile bir hafif zincirin V kısmına bağlanmış bir ağır zincirin V kısmından oluşan tek-zincir antikor fragmentleri (scFv), daha küçük boyutlarda olması, bakteri sistemlerinde daha ucuz ve kolaylıkla üretilebilmesi ve hedef antijene karşı, antikorlara benzer düzeyde, yüksek seçicilik ve afinite göstermelerinden dolayı, son zamanlarda tam-antikorlar yerine kullanılabilmektedir. Biyofarmasötik proteinler küresel ilaç pazarının yaklaşık yarıya yakınını oluşturmaktadır. Biyofarmasötik ürünlerin çoğunluğunu monoklonal antikor ve antikor fragmentleri kapsamaktadır. Rekombinant protein üretiminde yaygın olarak kullanılan Escherichia coli'nin, üretim maliyetlerini düşürdüğü, verimliliğin arttırdığı ve diğer mikroorganizmalara kıyasla manipülasyonu daha kolay olduğu bilinmektedir. Literatürde, disülfit bağı içeren anti-HER2 scFv'nin optimum üretim yerinin belirlenmesine yönelik E. coli'nin üç farklı bölmesindeki üretimlerin bir arada olduğu, bu bölgelere özgü farklı yolakları kullanan birbirinden farklı sinyal peptitleri ve suş kullanılarak karşılaştırılmasına ve üç bölme arasında optimum üretim yerinin belirlenmesine yönelik bir çalışma bulunmamaktadır. Yapılan tez çalışmasında, meme kanseri hücrelerinde normalden fazla miktarda ortaya çıkan insan epidermal büyüme reseptörü 2 (HER2)'ye karşı seçici anti-HER2 scFv'nin, genetiği değiştirilmiş ticari E. coli bakterisinin SHuffle T7 Express suşunda sitoplazmik bölgede üretimi, BL21(DE3) suşunda DsbA, MBP sinyal peptitleri kullanarak yapılan tasarımla periplazmik ve YebF sinyal peptidi kullanarak yapılan tasarımla hücre dışında üretimleri karşılaştırılmıştır. Üretim sonrası >99% oranında saflaştırılan scFv'lerin, çözünür ve aktif formda oldukları yapılan çalışmada gösterilmiştir. Sıcaklık taraması yapılarak, üretim için uygun sıcaklık belirlenmiştir. Üretim sürecinin optimize edilmesinin ardından scFv'ler farklı yönleri ile kıyaslanmıştır. Özgüllükleri değerlendirilen periplazmik, sitoplazmik ve ekstraselüler örnekler, in vitro analizlerde antijene doğru şekilde bağlanmıştır. Sitoplazmik örneğin üretim verimi 6,2 mg/L iken, spMBP ile yapılan periplazmik üretimin verimi 5,1 mg/L, hücre dışı üretim verimi ise 2,5 mg/L olarak bulunmuştur. Ayrıca, özgül ısı ve erime sıcaklıklarına (Tm) bakıldığında, sitoplazmik örneğin termal olarak daha kararlı olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Özetle bu çalışma, tıbbi tanı ve tedavide rol oynayan, rekombinant DNA teknolojisi ile üretilecek ve disülfit bağı içeren proteinlerin üretim maliyetlerini azaltım sürecine rehberlik edebilecek bir çalışma olmuştur. Özellikle anti-HER2 scFv'nin aktif ve çözünür formdaki üretimi, kompleks proteinlere özgü yöntemler ve suşlar kullanarak E. coli'de klonlanması ve farklı yönleriyle değerlendirilmesi literatüre önemli bir katkı sağlayacaktır.
İmplant kaynaklı enfeksiyon etkeni olan staphylococcus epidermidis'e özgü aptamer geliştirilmesi ve aptamerin biyofilm oluşumuna etkisinin in vitro koşullarda incelenmesi
Çeşitli hastalıklar ile birlikte kazalar sonucunda hasar alan ya da kaybedilen doku veya organların yerini alan biyomalzemelerle ilgili klinikte karşılaşılan en büyük sorunlardan biri enfeksiyon oluşumudur. Enfeksiyon oluşumuna biyofilm oluşturarak sebep olan etkenlerin başında Staphylococcus epidermidis gelmekte olup, bu bakteri normal deri florasının bir elemanı olmasına rağmen implantasyon sırasında vücut içerisine girerek patojen konuma geçmektedir. Biyofilm oluşumu sonrasında rutin antibiyotik tedavileri yeterli olmamakla birlikte, birçok dezavantajı da bulunmaktadır. Bu nedenle antibiyotiklere alternatif olabilecek veya destekleyici yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Tez çalışması kapsamında implant kaynaklı osteomyelit oluşumuna neden olan S. epidermidis bakterisinin biyofilm ilişkili Aap (birikimle ilişkili protein) proteininin ait iki farklı bölgesine karşı SELEX (üstel zenginleştirme ile ligandların sistematik evrimi) yöntemi ile aptamer seçilimi yapılmış ve biyofilm oluşumu üzerine etkileri hem kitosan ile kaplama yapılan hem de yapılmayan titanyum yüzeylerinde incelenmiştir. İlk aşamada A1.0, B1.0 ve B1.5 olmak üzere Aap proteininin farklı alt-kısımlarının kombinasyonları yapılarak rekombinant üretimi sağlanmıştır. A1.0 ve B1.0 adlı parçaları daha yüksek oranda ve miktarda saflaştırıldığı için, bu parçaların afinite immobilizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Sonraki aşamada SELEX yönteminde kullanılacak olan aptamer kütüphanesi ve primerleri tasarlanarak sentezlettirilmiştir. Primerler ile aptamer kütüphanesinin polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılması ve uygunluğunun belirlenmesi için optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Sekiz SELEX döngüsü sonrasında elde edilen aptamer havuzunun klonlanarak dizi analizi yapılmış ve seçilen aday aptamerlerin ayrılma sabitleri ELONA (Enzime Bağlı Oligonükleotid Analizi) yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. En son aşamada ise titanyum yüzeylerinin kitosan ile kaplanmasında farklı molekül ağırlığı ve derişimi kullanılmış olup, yüzeylerin karakterizasyonu SEM, EDX ve ATR-FTIR analizleri ile gerçekleştirilmiştir. Seçilen aday aptamerlerin kitosan ile kaplama yapılan ve yapılmayan titanyum yüzeyler üzerindeki etkisi hem kristal viyole kullanılarak yapılan mikroplak testi hem de SEM analiz sonuçları ile tespit edilmiştir. Seçilen 6 aday aptamer içerisinde en yüksek bağlanma afinitesine (10,2 nM) sahip olan ve biyofilm oluşumu üzerinde en etkili olan aptamerin AC31 kodlu aptamer olduğu belirlenmiştir. AC31 aptameri varlığında, kaplama yapılmayan titanyum yüzeyler üzerinde biyofilm oluşumunu engelleme oranının en az 4-kat olduğu, kitosan ile kaplama yapılan titanyum yüzeylerde ise en az 2-kat olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak, S. epidermidis bakterisinin biyofilm ilişkili Aap proteinine ait iki farklı bölgesine karşı SELEX yöntemi ile aptamer seçilimi ilk kez bu çalışma kapsamında gerçekleştirilmiştir. AC31 aptamerinin, titanyum yüzeyler üzerinde S. epidermidis'in yapışma mekanizması üzerinde etkisini göstererek biyofilm oluşumuna engel olduğu gösterilmiş ve yapılacak in vivo çalışmaların ardından terapötik ajan olarak kullanımının önü açılmıştır.
Plateletçe zengin plazmanın ayrımı için disk tabanlı bir sistemin tasarımı ve geliştirilmesi
Kan, % 55'i plazma denilen sıvıdan ve % 45'i şekilli kan hücrelerinden oluşur. Plazmanın ana görevi besin, atık ürünler, antikorlar, pıhtılaşma proteinleri, hormonlar, vücudun sıvı dengesini korumaya yardımcı proteinler ve kan hücrelerini taşımaktır. Günümüzde yaralı bağ dokunun iyileştirilmesine yönelik kullanımının yanı sıra estetik açıdan da yeni bir yaklaşım sunan plateletçe zengin plazma (PZP) tedavisi, hastanın kendi platelet derişimlerinin enjeksiyonu ile gerçekleştirilen popüler bir uygulamadır. Bu yöntemde, iyileştirme ve geliştirmeye yönelik her bir hastanın kendi iyileşme sistemini kullanarak immun riski en aza indirmek amaçlanmaktadır. PZP tedavisinin daha etkili sonuç verebilmesi için kandan istenilen oranda ve yüksek saflıkta platelet elde edilmesi gereklidir. Bu amaçla günümüzde sadece ticari olarak piyasada bulunan PZP kan tüpleri ve santrifüj yöntemi kullanılmaktadır. Kullanılan 2 ayrı yöntem bulunmaktadır. Bunlar tek santrifüj ile PZP eldesi ve çift santrifüj işlemi ile PZP eldesidir. Tek santrifüj işleminde genellikle kısa sürede yüksek hızlarda, çift santrifüj işleminde ise uzun sürede ve değişken hızlarda santrifüj işlemi yapıldığından, platelet hücrelerinin strese girmelerine, hasar görmelerine, aktif olmalarına, topaklanmalarına ve istenilen saflıkta elde edilememelerine neden olmaktadır. Sunulan tez çalışmasında bu problemlerin en aza indirilebilmesi için, disk tabanlı bir PZP ayırma kiti geliştirilmiştir. Bu ayırma kitinin geliştirilmesinde üç farklı basamak bulunmaktadır. Bunlar sırasıyla, disk tabanlı sistemin geliştirilmesi, santrifüj cihazının geliştirilmesi ve tiksotropik jel'in geliştirilmesidir. Bu amaç doğrultusunda kandaki plateletçe zengin bölgenin hızlı ve basit bir şekilde ayrılmasını sağlamak için ilk olarak, farklı tasarımlara sahip disk tabanlı sistemler Solidworks 2018 Premium programı ile 2- Boyutlu ve 3-Boyutlu olarak geliştirilerek etkinlikleri incelenmiştir. Bu doğrultuda farklı kanal yapıları, kanal tasarımları, yükleme aparatları gibi parametreler kan numunesinin miktarına ve kırmızı kan hücresi/plazma oranına göre optimize edilerek en uygun disk tasarımı belirlenmiştir. Tasarım, lazer kesim cihazı yardımıyla Polimetilmetakrilat (PMMA) tabakalar ve 130 μm kalınlığa sahip çift taraflı bant katmanlarından oluşturulmuştur. İkinci aşamada, disk tabanlı sisteme uygun bir santrifüj cihazı geliştirilmiştir . Bunun için STM32F103 geliştirme kartı programlanarak BLDC Grand Turbo GT2215/09 motor ile birleştirilerek disk tabanlı sisteme uygun merkezkaç kuvvetinin uygulanmasını sağlayacak şekilde tasarlanmıştır. Disk tabanlı sistemin santrifüj işlemi sırasında görüntülenmesini sağlamak için Arduino Uno geliştirme kartı programlanarak Power led'li stroboskop sistemi ile Canon Eos 450D fotoğraf makinesi kullanılmıştır. Üçüncü aşamada ise kandan etkin bir şekilde PZP eldesi için disk tasarımına entegre edilmek üzere tiksotropik jel geliştirilmiştir. Bu jel, ticari olarak piyasada bulunan bir jel ile karşılaştırılarak FTIR ve reolojik özellikleri belirlenmiştir. Reolojik analizler sonucunda, geliştirilen jelin tiksotropik olduğu sonucuna varılmıştır. Sonuç olarak çalışma neticesinde, geliştirilen tiksotropik jelin entegre edildiği uçak tasarımında denemesi yapılan Z şekilli kanal ile elde edilen PZP'nin, platelet sayım analizi yapılmıştır. Analiz sonucuna göre elde edilen PZP'nin tam kandaki platelet sayısını zenginleştirme faktörünün 3,53 kat olduğu tespit edilmiştir. Böylelikle tam kandan, disk tasarımı nedeniyle uygulamada kolay, platelet hücrelerini strese sokmadan düşük santrifüjleme hızında, daha kısa sürede ve uygun maliyetli kırmızı kan hücrelerini ayırıcı jel içeren bir disk tabanlı sistem kullanılarak, PZP eldesi başarı ile gerçekleştirilmiştir. Geliştirilen bu ayırma yönteminin farklı tıbbi amaçlar için PZP uygulamalarında önemli bir ilerleme sağlayacağına inanıyoruz.
Kompozit interferans vidaların geliştirilmesi
Ön çapraz bağ, diz ekleminde femur ve tibia kemiklerini birbirine bağlayan yapılardan biridir. Dizin normal işlev görmesi için çok önemli olan bu bağ, tibia kemiğinin anormal bir şekilde öne doğru yer değiştirmesini engelleyen en önemli yapıdır. Ön çapraz bağ kopması çok yaygın bir spor yaralanmasıdır. Rekonstrüksiyon cerrahisi bu tip yaralanmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Ön çapraz bağ yaralanması olan bireylerde tedavideki amaç dizdeki boşluk ve emniyetsizlik hissini ortadan kaldırmak, kişinin spor veya zorlayıcı aktiviteler sırasında güvenle basabileceği bir diz elde etmektir. Cerrahinin başka bir amacı ön çapraz bağ yaralanması olan kişileri, yaralanma öncesinde bulundukları sağlık seviyesine geri döndürmek ve dizde yeni yaralanmalar oluşmasını engellemektir. Bağ tamiri için genellikle diz çevresindeki kasların kirişleri kullanılır. Bunun için en sık kullanılan dokular dizin ön kısmında yer alan patellar tendon ve dizin arka kısmında yer alan hamstring tendonlarıdır. Bu ameliyatlarda greft adı verilen, kişinin kendisinden alınan bu yeni bağın geçeceği yolu hazırlamak için diz eklemindeki kemiklere tüneller açılır. Bu tendonların ameliyatlarda implante edilmesi için, bağı yerinde tutan ve biyolojik olarak absorbe edilebilir interferans vidalar yaygın olarak tercih edilmektedir. Bu tez çalışmasında ön çapraz bağ ameliyatlarında kullanılan, vücut içinde implante edildikten sonra belirli bir süre sonunda vücut tarafından emilebilen kompozit interferans vidaların ağırlıkça 70/30 % Poli(Laktik Asit-ko-Glikolik Asit) (PLGA) ve β-Trikalsiyum Fosfat (β-TCP) kullanılarak farklı uzunluk ve çaplarda elde edilmesi ve elde edilen vidaların fiziksel, kimyasal ve biyolojik testlerinin sonuçlarının değerlendirilmesi gerçekleştirilmiştir. Buna göre, belirlenen oranda bileşen içeren kompozit denemeleri ile beraber proses sonrası polimerdeki değişime kimyasal olarak bakılmış; sıcaklık, basınç, kurutma gibi proses parametreleri geliştirilmiş ve değerlendirilmiş, ısıl işlemlerin polimer üzerindeki etkileri kimyasal olarak araştırılmış, kompozit interferans vidalar mekanik olarak incelenmiştir. Tez çalışmasının nihai çıktısı kompozit interferans vida üzerinde gerçekleştirilen TGA analizi sonucunda; ağırlıkça 71.08 % PLGA miktarı ve 28.90 % β-TCP miktarı belirlenmiştir. DSC analizi sonucunda; Tg değeri 60.40 (ºC), Tm değeri ise 162.16 (ºC) olarak belirlenmiştir. FT-IR analizi sonucunda; 543 cm-1, 604 cm-1, 945 cm-1, 970 cm-1 bantlarında PO43- (fosfat) grubu pikleri görülmüştür. 1748 cm-1 bandında ise (-C=O-) karbonil pik noktası görülmüştür. Ca3(PO4)2 gruplarının varlığı XRD analizi yardımıyla gerçekleştirilmiştir. Numunedeki kristal boyutu Scherrer formülü yardımıyla 26 nanometre olarak hesaplanmıştır. Hammaddeye uygulanan ICP-MS analizi yardımıyla malzemede Pb (Kurşun) miktarı 0.58 ± 0.03 mg/kg (ppm), Cd (Kadmiyum) miktarı ise 0.19 ± 0.01 mg/kg (ppm) olarak belirlenmiştir. Arsenik ve civa miktarı ise tayin sınırının altında yer almıştır. µ-CT analizi yardımıyla madde yoğunluğunun hacmen %99.99 olduğu belirlenmiştir. 557 tane kapalı por tespit edilmiştir. Altı aylık degradasyon çalışması sırasında başlangıç anında İnherent Viskozite değeri 1,56 dl/g olarak hesaplanmıştır. Pürüzlülük ise yaklaşık olarak 25 µm olarak hesaplanmıştır. Yine başlangıç anı için gerçekleştirilen static torsiyon analizi sonuçlarına göre; Burulma Akma Dayanımı ortalama 6.2 (N.m), Maksimum Tork ortalama 6.6 (N.m) ve Kırılma Açısı ortalama 43 (°) olarak belirlenmiştir.
İn vitro diyagnostik sistemlerde kullanılmak üzere yeni nesil elektrotların tasarımı ve geliştirilmesi
Bu çalışmada, in vitro diyagnostik sistem uygulamaları için altın ve elmas benzeri karbon (DLC) ince film özelliklerine sahip elektrotların ilk kez üretilmesi amaçlanmıştır. Çok fonksiyonlu yüzey ve yığın özelliklerine sahip, iletken altın nanoağ bağlı elmas benzeri karbon nanofilm (CGN-DLC) elektrotların hazırlanması için kendiliğinden düzenlenme (self-assembly) yöntemi kullanılmıştır. Geliştirilen nanofilmlerin nispeten yüksek bir sp3 karbon dağılımına, 1,4 × 103 S.cm-1 elektrik iletkenliğine ve 1,42 eV ve 3,87 eV optik bant aralıklarına sahip oldukları bulunmuştur. Azalan tam yansıma-fourier dönüşümü kızılötesi (ATR-FTIR) spektroskopisi ve X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS) analizleri, DLC yüzeyinde karboksilik asit fonksiyonel gruplarının varlığını ortaya çıkarmıştır. CGN-DLC nanofilmlerinin kalitatif ve kantitatif olarak değerlendirilmesinde yüksek çözünürlüklü geçirimli elektron mikroskopisi (TEM), taramalı elektron mikroskopisi (SEM), X-ışını kırınımı (XRD), RAMAN spektroskopisi, dönüşümlü voltametri (CV) ve elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EİS) kullanılmıştır. TEM ve SEM analizleri, CGN-DLC nanofilmlerini üretmek için trisodyum sitrat ve altın nanopartiküllerinin başarılı bir şekilde kullanıldığını göstermiştir. XRD spektrumundan, altın nanoağ yapısına ait Au (111), Au (200), Au (220) ve Au (311) pikleri ve DLC yapısına ait C (002), C (032) ve C (111) pikleri belirlenmiştir. RAMAN spektroskopisi elmas benzeri karbon yapının D ve G bandı piklerini sırasıyla 1388,6 cm-1 ve 1568,0 cm-1 konumlarında göstermiştir. DLC filminin sp3 içeriği de yaklaşık % 30 bulunmuştur. CV ve EİS, CGN-DLC nanofilmlerinin biyosensör uygulamalarında etkili modifiye edici ajan olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Sunulan tez kapsamında, zararlı kimyasallar veya fiziksel yöntemler kullanılmadan CGN-DLC nanofilmlerinin elde edilmesi için sürdürülebilir bir yöntem gösterilmiştir. CGN-DLC nanofilm performansını değerlendirmek için, sentezlenen nanofilm kalem grafit elektrot (PGE) üzerine modifiye edilmiş ve prostat kanseri biyobelirteci olan miRNA-410-5p'nin hassas ve seçici olarak elektrokimyasal tayini gerçekleştirilmiştir. Tasarlanan biyosensör platform üzerinde herhangi bir amplifikasyon ve/veya etiketleme işlemi kullanılmamıştır. Hazırlanan biyosensör platformu, 0,3 fM ile 100 fM doğrusal aralığı ve 0,27 fM'lik bir tayin sınırı (LOD) ile diferansiyel puls voltametri (DPV) yöntemi kullanılarak hedef miRNA'ları saptamıştır. Sonuç olarak, sentezlenen CGN-DLC nanofilminin biyo/sensörler, fotovoltaikler, transistörler, amplifikatörler, enerji depolama unsurları ve biyomedikal gibi geniş uygulama alanlarında kullanılması gelecek çalışmalarda beklenmektedir.
Tetrasiklin tayinine yönelik aptamer bağlı peroksidaz benzeri mikropartiküllerin geliştirilmesi
İnsan güvenliğini ve sağlığını korumak için gıdalarda ve sularda biriken antibiyotik kalıntılarının tayinine yönelik hassas ve seçici yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Kullanımı yaygın olan tetrasiklinin kalıntılarının tayini için kullanılan geleneksel yöntemlerin zaman alıcı olması, profesyonel çalışma becerisi gerektirmesi ve tayin için yüksek maliyetli cihazlar kullanılması gibi dezavantajları vardır. Sunulan tez kapsamında, sulu çözeltilerde tetrasiklin antibiyotiğinin tayini için peroksidaz benzeri aktivite gösteren manyetik mikropartikül ve aptamerden oluşan bir biyosensörün geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada kullanılan peroksidaz benzeri aktivite gösteren manyetik mikropartiküller, son yıllarda kullanılan tetrasiklinin tayin yöntemlerine alternatif oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu kapsamda, (3-glisidiloksipropil) trimetoksisilan (GLYMO)-bağlı manyetik silika (MagSiO2) mikropartiküller ve (3-aminopropil)trietoksisilan (APTES)-bağlı mikropartiküller sentezlenmiştir. GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin sentezi için, MagSiO2 mikropartikülleri, tolüen ve GLYMO ile 110ºC'de reflux sisteminde 8 saat boyunca reaksiyona girmiştir. Mikropartiküller sırasıyla etanol, ddH2O ve sodyum karbonat (Na2CO3) ile yıkandıktan sonra etilendiamin ve Na2CO3 ile 60ºC'de t=24 st boyunca reaksiyona bırakılmıştır. Reaksiyonun ardından mikropartiküller sırasıyla fosfat tampon çözeltisi (PB) ve ddH2O ile yıkandıktan sonra gravimetrik analiz ile partikülün yoğunluğu belirlenmiş ve mikropartiküller tekrar PB ile yıkanmıştır. APTES-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin sentezi için APTES, MagSiO2 mikropartikülleri, tolüen ve tris-etilamin ile de benzer bir sentez yöntemi izlenmiştir. Mikropartiküllerin peroksidaz benzeri aktivitesini ölçmek için o-fenilendiamin (OPD) kullanılmıştır. GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin, APTES-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerden daha fazla absorbans değeri verdiği görülmüştür. Gluteraldehit çapraz bağlayacısı ile GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküller 18-24 saat süre aralığında, oda sıcaklığında ve karanlıkta reaksiyona girmiş, sonrasında partiküller PB ile yıkanmıştır. Aptamerler ise 5 dakika boyunca 95°C'de denature edildikten sonra 10 dk buzun üzerinde bekletilmiş; aptamer çözeltisi ve mikropartiküller oda sıcaklığında t=2 st boyunca reaksiyona bırakılmıştır. Aptamer tutuklanmış mikropartiküller, PB ile yıkandıktan sonra tetrasiklin çözeltisi (100-200-500-1000-2000 ng/µl) ile karanlıkta t=30 dk boyunca reaksiyona girmiştir. Partikül-aptamer-tetrasiklin PB ile yıkandıktan sonra OPD ile oda sıcaklığında ve karanlıkta, t=45-75 dk zaman aralığında reaksiyona bırakılmıştır. Farklı iyon ve derişimlere sahip tampon çözeltiler kullanılarak değişen aptamerin katlanma şeklinin ve aptamer yoğunluğunun tetrasiklin tayinine olan etkisi de incelenmiştir. OPD çözeltisi hazırlanırken pH, ortam tampon çözeltisi, çözeltinin derişimi ve H2O2 miktarının optimizasyonu yapılmıştır. Plaka okuyucuda OD=450 nm'de yapılan ölçümler sonucunda pH=7 olan fosfat sitrat tampon çözeltisi ile hazırlanmış 10 mM OPD solüsyonu kullanıldığında en yüksek ΔA değerine ulaşılmış ve t=60 dk'nın optimum reaksiyon süresi olduğu sonucuna varılmıştır. OPD'nin reaksiyonunu durdurmak için 3 M HCl kullanılmış, OD=492 nm'de yapılan ölçümler sonucunda HCl miktarı arttıkça absorbans değerinin arttığı, ancak ΔA değerinin azaldığı tespit edilmiştir. Yapılan tüm optimizasyon çalışmaları neticesinde tetrasiklin derişimi taranmış, alt tespit limiti LOD=100 ng/µl olarak bulunmuştur. Sütte izin verilen tetrasiklinin maksimum kalıntı limitleri ise Avrupa Birliği'nde 200 ng/µl'dir. Sonuç olarak bu çalışmada, tetrasiklini tayinine yönelik kullanımı kolay, düşük maliyetli, enzim benzeri özellik gösteren mikropartiküller ile aptamer-bağlı bir biyosensör geliştirilmiştir.
Trikalsiyum fosfata bağlanmış mezenkimal kök hücre eksozomlarının kemik yenilenmesine etkisi
Kemik fizyolojik koşullarda kendini yenileyebilen bir doku olmasına rağmen metabolik hastalıkları, nekrotik ya da travmatik hasarlarında yapı ve işlevleri bozulabilir. Kritik kemik kayıplarının, kemik inorganik matriksinin ana bileşeni osteokondüktif kalsiyum fosfat bileşiklerinin yanında osteoindüktif büyüme faktörleri ya da bunlara kaynak sağlayan kök/öncül hücreler ile desteklenmesi gereklidir. Mezenkimal kök hücre eksozomları, kemikte rejeneratif etkili molekülleri içermeleri, hedef hücreye kolayca alınmaları ve immün yanıt oluşturmamaları nedeniyle, mezenkimal kök hücreler yerine tercih edilebilir. Bu çalışmada anneksin V ile kalsiyum eksik hidroksiapatite kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomları bağlanarak oluşturulan biyomühendislik temelli formülasyon ile osteoblastların çoğalma, matriks sentezi ve mineralizasyonunun uyarılabileceği varsayılmıştır. Bu hipotezi test etmek için, deney ve kontrol gruplarını içeren in vitro deney düzeneğinde (1) kalsiyum eksik hidroksiapatitin üretilmesi ve karakterizasyonu, (2) insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının izolasyonu ve karakterizasyonu, (3) kalsiyum eksik hidroksiapatit ve insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının anneksin V aracılığı ile bağlanması, bağlanma ve salımın karakterizasyonu, (4) oluşan bu formülasyonun osteoblastların çoğalma ve mineralizasyonuna etkisinin değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Hedefler doğrultusunda kimyasal çöktürme yöntemiyle kalsiyum eksik hidroksiapatit sentezi gerçekleştirilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatitin X-ışını difraksiyonuyla ve Raman spektroskopisiyle yapısal karakterizasyonu, geçirimli elektron mikroskobunda morfolojik karakterizasyonu yapılmıştır. İnsan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler morfoloji, kültür plağına tutunma, spesifik yüzey belirteçleri ve kondrojenik farklılaşma analizi yöntemleriyle karakterize edildikten sonra ultrasantrifüjleme ve MACS yöntemleriyle eksozomları izole edilmiştir. Eksozomlar transmisyon elektron mikroskobunda değerlendirilmiş; BCA analizi ile protein konsantrasyonları, NTA yöntemiyle partikül sayısının ve partikül boyutlarının analizi yapılmıştır. Akım sitometresiyle CD 9 ile yakalanan eksozomların CD63 ile ve CD81 ile işaretlendikleri, her üç belirtece de sahip oldukları gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatite, anneksin V aracılığıyla insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının bağlanması; Raman spektroskopisi ve jel elektroforezi ile gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatite bağlı eksozomların BCA analiz yöntemi ile ilk 12 saatte büyük çoğunluğunu kontrollü olarak saldığı gösterilmiştir. Kalsiyum eksik hidroksiapatit ve insan kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının insan fetal osteoblastlarındaki etkili proliferatif dozu gerçek zamanlı impedans temelli olarak 1. günden 3. güne ölçülmüş ve sırasıyla 0.1 µg/ml ve 25 µg/ml olarak belirlenmiştir. Belirlenen etkili dozlarda hazırlanan formülasyon osteoblastlara uygulandığında gerçek zamanlı olarak osteoblastların çoğaldıkları; matriks sentezi ve mineralizasyonu gösteren ALP aktivitesinin 0-7 gün zaman aralığında kontrol grubuna göre arttığı saptanmıştır. Sonuç olarak bu tez çalışması ile ilk kez kalsiyum eksik hidroksiapatit, anneksin V ile kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarına bağlanarak orijinal ve yenilikçi, yüksek teknolojik, kişiye özel ve hedefli bir formülasyon geliştirilerek in vitro koşullarda insan osteoblastlarındaki yenileyici etkisi ortaya konmuştur. Bu yeni formülasyonun in vivo hastalık modellerindeki deneysel validasyonunu takiben klinikteki metabolik ya da travmatik kemik hasarlarının onarılmasında otojenik, kişiye özel ya da allojenik bir tedavi ajanı olarak yer alma potansiyeli bulunmaktadır. Tez kapsamındaki biyomühendislik temelli yeni tedavi ürününün ülkemizin ortopedik hastalıkların tedavisine ait uluslararası pazarda rekabet gücünü arttırma hedefini karşılaması önemlidir. Bu kapsamda, tezden elde edilen çıktılar ile Hacettepe Teknokent Teknoloji Transfer Merkezi Patent Ofisine patent başvurusu yapılmıştır (Başvuru no: 2021/002221).
Gıda örneklerindeki benzil penisilin hassas tayinine yönelik moleküler baskılanmış polimer temelli optik sensörlerin geliştirilmesi
Penisilin en sık kullanılan beta antibiyotiklerden olup, insan, çiftlik hayvanları, kümes hayvanları ve su ürünleri yetiştiriciliğinde çeşitli bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde uzun süredir yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yüzden, gıda ve çevredeki bu antibiyotik kalıntılarının tespiti halk sağlığının korunması açısından hayati önem taşımaktadır. Bu çalışmada, yüzey plazmon rezonans sensör ile moleküler baskılama tekniği kullanılarak hem sulu çözelti hem de süt örneklerinden seçici ve hassas benzilpenisilin (PEN-G) antibiyotiğinin tayini gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, PEN-G baskılanmış, poli(2-Hidroksietil metakrilat- N-metakroil-(L)-sistein metil ester-altın nanopartiküller-N-metakroil-(L)-fenilalanin metil ester (MIP-AuNPs) nanosensör hazırlanmıştır. Yüzey plazmon rezonans sinyal yanıtını arttırmak amacıyla eklenen altın nanopartiküllerin (AuNPs) etkisini incelemek için eklenmeden hazırlanan nanosensör AuNPs (MIP) ile kontrol deneyleri gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, baskılama verimliliğini incelemek amacı ile, PEN-G baskılanmamış (NIP-AuNPs) nanosensör, PEN-G molekülünün eklenmesi dışında aynı polimerizasyon reçetesi kullanılarak hazırlanmıştır. MIP-AuNPs nanosensörü için baskılamanın verimliliği (I.F 7.83), NIP- AuNPs nanosensörü ile karşılaştırılarak tespit edilmiştir. MIP-AuNPs nanosensörün, hedef PEN-G molekülü için amoksisiline göre 9.87 kat ve ampisiline göre 16.78 kat daha seçici olduğu belirlenmiştir. MIP-AuNPs nanosensör, 0.01-5 ppb PEN-G konsantrasyon aralığı için, 0.9992 korrelasyon katsayısı ile doğrusal ilişki gösterdi. MIP-AuNPs nanosensörün tekrarlanabilirlik çalışmaları, 0.25 ppb PEN-G için istatistiksel olarak analiz edilmiş ve hesaplanan yüzde nispi standart sapma değeri (RSD%<1.7), aynı sensörün dört adsorpsiyon-desorpsiyon döngüsünden sonra PEN- G algılama yeteneğinde kayda değer bir kayıp olmadığını göstermiştir. Ayrıca gerçek gıda numunesi olarak, sütün içine 5 ppb PEN-G eklenerek sütteki PEN-G miktarı tespit edilmiştir. Validasyon çalışmaları yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) çalışmaları ile gerçekleştirilmiştir. Anahtar kavramlar: altın nanopartiküller, moleküler baskılanmış polimer, nanosensör, benzilpenisilin, yüzey plazmon rezonans.
Mikroakışkan çiplerde biyomoleküllerin ve hücrelerin difüzyonunun incelenmesi
Mikroakışkan sistemler, analitik kimya, ilaç keşif ve geliştirme araştırmaları, tanı amaçlı kitler, taşınabilir hasta başı kitleri, enzimatik-kimyasal sentez, biyolojik moleküllerin tayini, çip-üstü-organ uygulamaları gibi tıp ve yaşam bilimleri çalışmalarının birçok alanında geniş bir kullanıma sahiptir. Mikroakışkan çipler çok düşük hacimlerde bile hızlı sonuç verebilme, yüksek verimlilik ve tekrarlanabilirliğe sahip sonuçlar elde edebilme gibi avantajlarından dolayı son zamanlarda oldukça ilgi görmektedir. Mikroakışkan teknolojilerin temel hedefi, biyoteknoloji, biyomedikal ve ilaç endüstrilerine yenilikçi ve düşük maliyetli mikroakışkan cihazlar sunabilmektir. Bu nedenle, mikroakışkan sistemlerde hücre ve biyomoleküllerin taşınım olaylarının anlaşılması oldukça önemli olmaktadır. Bu tez çalışmasında saponin glikozidlerinin biyokatalitik dönüşümlerini gerçekleştirebilen bir mikroakışkan çipte substrat moleküllerin difüzyon olayları incelenerek, matematiksel modellemesi yapılmıştır. Bunun için sisteme akış eşliğinde zamana bağlı olarak belirli konsantrasyondaki substrat solüsyonu beslenmiş ve çıkış akımları toplanmıştır. Zamana bağlı çıkış akımı madde konsantrasyonları analizlenmiş ve Fick yasası difüzyon modelinden yararlanılarak moleküllerin hidrodinamik yayılım katsayıları belirlenmiştir. Ardından sistem değişkenleri arasındaki ilişkiyi gösteren, sistem dinamiklerinin tanınması ve ölçek büyütme için model oluşturan matematiksel model denklikleri oluşturulmuştur. Mikroakışkan çiplerde biyomoleküllerin difüzyonuna yönelik çalışmanın yanısıra, in vivo koşulları simüle eden, perfüzyon özelliğine sahip, sferoid tabanlı üç boyutlu (3B) çip-üstü-akciğer platformu geliştirilmiş ve potansiyel ilaç molekülünün sferoid yapıları içinde oluşturulan akciğer karsinoma hücre hattı üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bunun için potansiyel ilacın A549 akciğer karsinoma ve MRC-5 akciğer fibroblast hücre hatları üzerindeki sitotoksik aktivitesi belirlenmiş, ardından canlı doku arasında köprü niteliğinde olan in vivo 3B dinamik mikroakışkan hücre kültürü sistemlerinde uygulanan ilacın etkinliği araştırılmıştır. Mikroakışkan çiplerde 3B yapının oluşturulması için matrijel matriks tabanlı sferoid kültürü yapılmıştır. Sferoidlerin morfolojileri zamana bağlı olarak ışık mikroskobu ile gözlenmiş ve sferoid boyutu ve sayıları ImageJ analizi ile belirlenmiştir. Ayrıca sferoidlerin hücre canlılığı, deneme sonunda canlı ve ölü floresan boyama testi ile incelenmiştir. Bu çalışmada çip-üstü-akciğer platformunda geliştirilen 3B akciğer sferoid kültürü iyi organize edilmiş sferoid oluşumunun yanısıra, aynı zamanda kanser mikroçevresini taklit eden hücre-hücre etkileşim etkisinin niceliksel ve niteliksel olarak daha iyi anlaşılmasına da katkı sağlamıştır.
Ülkemiz kayısı genetik kaynaklarında bazı agronomik özellikler ile DNA markörleri arasındaki ilişkilerin ilişki haritalama (association mapping) ile saptanması ve biyoçeşitliliğin moleküler düzeyde belirlenmesi
İlişki haritalama (Association Mapping) isimli yöntem, farklı lokuslardaki allellerin bağlantı dengesizliğine (LD, Linkage disequilibrium) dayanan kantitatif özelliklerin haritalanması ve bu kantitatif özellikler ile markörler arasındaki ilişkinin belirlenmesi için geliştirilen güçlü ve etkili bir yöntemdir. Bu çalışmada Türkiye'nin ve dünyanın farklı yerlerinden elde edilmiş 259 kayısı genotipi kullanılarak (GBS) analizleri gerçekleştirilmiş ve analizler sonucunda 20.264 yüksek kalitede SNP markörü tespit edilmiştir. STRUCTURE programında, bu markörler kullanılarak popülasyon yapısı analiz edilmiş ve popülasyonun 3 (ΔK=3) alt gruba ayrıldığı belirlenmiştir. Saptanan SNP markörleri ile kayısı meyvelerinde meyve ağırlığı, meyve eti sertliği ve meyve eti rengine ait pomolojik veriler ile TASSEL (Trait Analysis by Association, Evoluation and Linkage) programı aracılığıyla MLM(Q+K) analizleri gerçekleştirilmiş ve bu 3 pomolojik özellik ile istatistiksel olarak yüksek ilişkili 4 SNP tanımlanmıştır. Bu çalışma kayısı meyvelerinde meyve ağırlığı, meyve eti sertliği ve meyve eti rengi özellikleri ile yapılan ilk ilişki haritalama çalışmasıdır ve gelecekteki ilişki haritalama, marker destekli seleksiyon ve ıslah çalışmalarına yardımcı olacaktır.
Meme kanseri tedavisinde kemoterapötik tedavi desteği olarak bifidobacterium infantis suşlarının kullanım potansiyelinin in vivo olarak araştırılması
Kanserin en tehlikeli en ölümcül hastalıklardan biri olmasının yanı sıra meme kanseri de kadınlarda teşhis edilen en yaygın kanser tipidir ve akciğer kanserinden sonra, kanser kaynaklı ölümler sıralamasında, ikinci sırada yer almaktadır. Meme kanserinde kullanılan tedaviler, cerrahi müdahale, radyoterapi, kemoterapi, hormon terapisi, hedef odaklı terapi ve immünoterapiyi içermektedir. Immünoterapi, hastalığın stabilizasyonunu sağlamak ya da objektif bir yanıt elde etmek için immün sistemi aktive etmekte ya da baskılamaktadır. Bu çalışmada Bifidobacterium infantis'in kemoterapi desteği olarak kullanımı, fare meme kanseri modellerinde in vivo olarak araştırılmıştır. İlk olarak, in vitro denemeler gerçekleştirilmiş ve doksorubisinin 4T1 hücreleri için IC50 değeri 0,053 μg / mL bulunmuştur. Ardından, in vivo denemelerde, 4T1 hücreleri enjekte edilen (2x10^4 hücre / fare) Balb/c farelere, 14 gün boyunca B.infantis sütü (10^8 kob / ml) gavaj yolu ile verilmiştir ve 5 ile 10. günlerde doksorubisin enjeksiyonu gerçekleştirilmiştir. Çalışma süresince fare ağırlıkları ölçülmüştür. On beşinci gün fareler sakrifiye edilmiş ve tümör boyutları kumpas ile ölçülmüştür. Farelerden alınan splenositlerin proliferasyonları analiz edilmiştir. Splenosit ve 4T1 hücre kültürü ile ko-kültür hazırlanmış ve sitotoksik etki mikroskop yardımı ile gözlenmiştir. CD8+ T hücre yanıtı, akıĢ sitometrisi ile analiz edilmiştir. Sonuçlar kontrol grubuna göre değerlendirilmiĢtir. Splenosit proliferasyonu ve CD8+ T hücre analizleri birbirlerini destekler niteliktedir. En iyi anti-tümör etki B.infantis doksorubisinin birlikte kullanıldığı grupta gözlenmiştir.
Mikroakışkan sistemlerde saponin moleküllerinin biyoaktivite destekli enzimatik hidrolizi
Küçük hacimlerdeki sıvıların işlenmesine olanak sağlayan mikroakışkan sistemler geleneksel sistemlere kıyasla yüksek ısı ve kütle transferi, düşük reaktif kullanımı, etkin karıştırma gibi avantajlara sahiptir. Bu tez çalışması kapsamında mikroakışkan sistemlerin sahip olduğu bu özellikleri enzimatik reaksiyonların avantajları ile birleştiren enzimatik mikroreaktörlerin geliştirilmesi ve geliştirilen bu sistemde saponin moleküllerinin hidroliz edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda β-glukosidaz enzimi silika ve aljinat hidrojeller içerisine immobilize edilmiş ve bu hidrojellerin morfoloji, yüzey alanı, por büyüklüğü, hacim değişimi gibi özellikleri karakterize edilerek serbest ve immobilize enzim için kinetik parametreler (Vmax ve KM) belirlenmiştir. Hidrojellerin karakterizasyonunun ardından enzimatik mikroreaktörler hazırlanmış ve model substrat olan pNPG ile saponin molekülleri olan ginsenosit Rb1, soyasaponin Bb ve soyasaponin Aa moleküllerinin hidrolizi gerçekleştirilmiştir. Gerçekleştirilen karakterizasyon çalışmalarında aljinat hidrojellerin sahip olduğu yüksek yüzey alanı (∼304 m2/g) ve gözenekli yapısı ile enzim immobilizasyonu için oldukça elverişli bir matris olduğu belirlenmiştir. Enzimatik mikoreaktörlerde gerçekleştirilen denemelerde kullanılan immobilizasyon yöntemi ile mikroreaktör içerisinde kalış süresinin reaksiyon verimini doğrudan etkilediği ve artan kalış süresi ile birlikte reaksiyon veriminin de arttığı tespit edilmiştir. Aynı kalış süresi için klasik yöntem olan reaksiyon tüpleri içerisinde serbest (%27) ve immobilize enzim (%16) ile gerçekleştirilen hidroliz denemeleri ile karşılaştırıldığında enzimatik mikroreaktörlerde çok daha yüksek substrat dönüşüm oranları (%37.52) elde edilmiştir. Saponin molekülleri asidik, serbest enzim ve enzimatik mikroreaktör ile hidrolize tabi tutulmuş, asidik hidroliz reaksiyonlarında ara ürünlerin yanı sıra istenmeyen yan ürün oluşumu gözlenirken enzimatik hidroliz reaksiyonlarında herhangi bir yan ürün oluşumunun gözlenmemesi enzimlerin kimyasal katalizörlere olan üstünlüğünü göstermiştir. Ginsenosit Rb1 için 15 dk kalış süresinde serbest enzim ile gerçekleştirilen hidroliz denemelerinde tek şeker molekülünün uzaklaştırılması ile elde edilen ginsenosit Rd molekülü tespit edilirken aynı kalış süresi için enzimatik mikroreaktörde gerçekleştirilen hidroliz sonrasında ginsenosit Rd'nin yanı sıra başlangıç molekülünden iki şeker molekülünün uzaklaştırılması ile oluşan ginsenosit F2 molekülüne de rastlanmıştır. Benzer şekilde soyasaponin Bb'nin serbest enzim ile hidrolizinde soyasaponin III ve soyasapogenol B monoglukuronit ara ürünleri elde edilirken mikroreaktörde gerçekleştirilen enzimatik hidroliz ile aglikon olan soyasapogenol B'ye ulaşılmıştır. Elde edilen bu sonuçlar kimyasal katalizörler ile kıyaslandığında enzimlerin yüksek substrat spesifikliğine sahip olduğu ve geleneksel sistemler ile karşılaştırıldığında enzimatik mikroreaktörlerin oldukça etkin sistemler olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak saponin ve aglikonlara ait standartların farklı kanser hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkisini belirlemek için MTT analizleri yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar soyasapogenollerin soyasaponinlerden daha yüksek sitotoksik aktiviteye sahip olduğunu gösterirken compound K'nın tüm hücre hatları üzerinde sitotoksik etki gösterdiği ve bu etkinin apoptoz ile gerçekleştiği belirlenmiştir. Anahtar Sözcükler: Enzimatik mikroreaktör, β-glukosidaz, hidrojel, ginsenosit Rb1, soyasaponinler, sitotoksisite.
Nanopartikül ve grafen katkılı doku mühendisliği ürünlerinin in vitro ve in vivo Parkinson modellerinde nörorejeneratif etkisinin incelenmesi
Bu tez çalışmasında Parkinson hastalığı (PH)'nın tedavisine yönelik bir doku mühendisliği ürünü geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaç doğrultusunda kendiliğinden dizilim (self assembly) yöntemi kullanılarak hem manyetik demir oksit nanopartikül hem de grafen katkılı peptid jel doku iskeleleri üretilmiştir. Üretilen doku iskeleleri, öncelikle in vitro ortamda oluşturulan Parkinson modelleri üzerinde denenmiş, daha sonra başarılı bulunanlar in vivo' ya aktarılmıştır. Ayrıca hastaya özel klinik kullanım potansiyelin belirlenmesi için kompozit doku iskeleleri üzerinde sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (Kİ-MKH) kullanılarak laboratuvar ortamında sağlıklı sinir dokusu üretimi denenmiş ve bu dokular da in vivo modelde kullanılarak hücreli ve hücresiz iskelelerin nörorejeneratif etkileri karşılaştırılmıştır. Böylelikle, Fe3O4 nanopartikül ve grafen katkısının hücreler ve/veya deney hayvanları üzerindeki nörorejeneratif etkisi tespit edilerek, doku mühendisliği yaklaşımlarının nörodejeneratif hastalıkların tedavisindeki terapötik potansiyeli değerlendirilmiştir.
Sağlıklı ve melanoma deri hücrelerinin birlikte kültürü ile geliştirilen in vitro hücre modellerinde UV ile uyarılan genotoksik etkinin comet analiz yöntemi ile belirlenmesi
UV radyasyonuna maruz kalmanın, açık havada çalışan yetişkinler için %10 ve toplam mevcut yıllık UV radyasyonunun (yatay düzlemdeki) kapalı alanda çalışan yetişkinler için %3 olduğu tahmin edilmektedir. Güneş yanığı, ışığa bağlı yaşlanma (fotoaging), bağışıklık sistemi bozuklukları, DNA hasarı ve deri kanseri gibi potansiyel zararlı sağlık etkileri göz önüne alındığında UV ışınlarının oluşturduğu genetik hasarların belirlenmesine ihtiyaç vardır. Bitirme tezi kapsamında UV radyasyon kaynaklı oluşan genetik hasarların in vivo yöntemlere alternatif olarak in vitro yöntemler olan comet analiz ve floresan mikronükleus testleri ile belirlenmesi amaçlanmıştır. Aynı zamanda UV radyasyona karşı koruyuculu bilinen ve dermokozmetik ürünlerde sıklıkla kullanılan β-karoten etken maddesinin etkinliğinin test edilmesi de yapılan bitirme tezinin amaçlarından biridir. Yapılan yüksek lisans tezi ile UV radyasyonun genotoksik etkisinin yadsınamaz ölçüde olduğu, güneş kremleri ve kozmetik ürünlerde bulunan β-karoten etken maddesinin ise UV radyasyonuna maruz kalınmadan önce uygulandığı takdirde oluşan genetik hasarı daha çok önlediği görülmüştür (Comet analiz; birlikte kültür sisteminde, HaCat hücre hattı: UV: %85,638, β- Karoten + UV: %18,67, UV + β- Karoten: %38,18, SK-MEL 30 hücre hattı: UV: %91,13, β- Karoten + UV: %23,67, UV + β- Karoten: %27,77, Detroit 551 hücre hattı: UV: %27,19, β- Karoten + UV: %5,35, UV + β- Karoten: %9,03- diğer deney setlerinde, HaCat hücre hattı: UV: %85,638, β- Karoten + UV: %16,92, UV + β- Karoten: %22,39, SK-MEL 30 hücre hattı: UV: %81,68, β- Karoten + UV: %16,86, UV + β- Karoten: %45,35, Detroit 551 hücre hattı: UV: %87,74, β- Karoten + UV: %29,29, UV + β- Karoten: %37,43, Floresan mikronükleus testi; birlikte kültür sisteminde, HaCat hücre hattı ile UV: %2, β- Karoten + UV: %0, UV + β- Karoten: %1; SK-MEL 30 hücre hattı ile; UV: %5; β- Karoten + UV: %3, UV + β- Karoten: %3- diğer deney setlerinde HaCat; UV: %30, β- Karoten + UV: %7, UV + β- Karoten: %16, Detroit-551; UV: %25, β- Karoten + UV: %7, UV + β- Karoten: %13 SK-MEL 30; UV: %20, β- Karoten + UV: %3, UV + β- Karoten: %8). Çalışma kapsamında comet analiz ve floresan mikronükleus yöntemleri kullanılmış ve bu yöntemlerden çıkan sonuçların birbirini destekler nitelikte olduğu görülmüştür. Uygulanan yöntemlerin optimizasyonu ile birlikte kültür sisteminde UV radyasyonu gibi ışınsal genotoksik maddelerin insert yüzeyinden geçemediği için birlikte kültürün alt tabakasındaki hücreleri etkilemediği fakat ortak besin ortamı ile birlikte kullanılan β-karoten gibi maddelerde birlikte kültür sisteminin etkili bir sistem olduğu görülmüştür. Çalışma sonuçlarının istatiksel analalizi Graphpad Prisim 5.0 programı ile tek yönlü varyans testi (ANOVA) uygulanarak yapılmıştır. Anahtar sözcükler: DNA Hasarı, Comet, Mikronükleus, Comet Analiz, UV Radyasyonu, β-karoten, UVA, Floresan Mikronükleus, Genotoksisite, Tanı
Bioactivity test and cell studies of bioceramics produced from Clinocardium ciliatum and Turritella terebra
Hydroxyapatite and tricalcium phosphate are used in field of drug delivery and bone regeneration due to their high biocompability behaviours. Hydroxyapatite was examined since it is dispersed in a organic matrix of composite structure of bone. Hydroxyapatite and TCP have the ability to accelarate bone growth around the implant. Highly porous TCP exhibits excellent behaviour as bone implant since it dissolves after replaced by bone. Natural bioceramics can be obtained from different sources such as bone and sea shells. Most of marine structures contains calcium carbonate (calcite or aragonite) and they can be easily converted to bioceramic material. In this study calcium phosphate nanoceramics obtained via mechanochemical method using the sea shell Clinocardium ciliatum and sea snail Turritella Terebra as a calcium source. The characteristics of the calcium phosphate ceramics that produced from two different sources were studied in two different sintering temperature: 1000 °C and 1200 °C. The characterization of the produced materials were carried out via FT-IR, SEM, BET, XRD analysis. Biodegradability test in TRIS fluid and bioactivity tests were performed for the produced materials. Fast hydroxyapatite formation occurred when the materials were immersed in simulated body fluid and proliferation of cells in cytotoxicity test was registered. As a result, hydroxyapatite, β-TCP and α-TCP were produced and their biodegradability and bioactivity behaviors were determined.
Characterisation of immobilised Geobacillus stearothermophilus L-arabinose isomerase
The L-arabinose isomerase from Geobacillus stearothermophilus was studied for the production of D-tagatose, a low-calorie bulk sweetener. Industrially, D-tagatose is only produced in a chemical way. However, a lot of waste and by-products are formed in this way. A biological synthesis of D-tagatose is not yet commercially available. In this work first, L-arabinose isomerase was intracellularly expressed in E. coli. The enzyme was isolated and purified. Hereby, three different L-arabinose isomerase fractions were obtained, namely the intracellular enzyme, crude extract and purified enzyme. This work is first to characterise and compare three different immobilised enzyme fractions from wild type Geobacillus stearothermophilus in a systematic approach. The L-AI activity was determined of the different enzyme fractions obtained during the isolation and purification. The L-AI activity in the intracellular enzyme, crude extract and purified enzyme were 8.55 ± 0.13 U/ml, 7.95 ± 0.03 U/ml and 6.75 ± 0.06 U/ml, respectively. Furthermore, prior to immobilisation, the intracellular enzyme and crude extract were diluted to the same protein concentration as the purified enzyme. The diluted intracellular enzyme, diluted crude extract and purified enzyme were prior to the immobilisation experiment, subjected to a conversion experiment at 60°C and pH 7.0. After 48 hours of incubation, D-tagatose concentrations of 67.2 ± 0.8 g/l, 61.3 ± 3.2 g/l and 68.7 ± 2.2 g/l were found, respectively. Conversion to D-tagatose was proven for all the enzyme fractions. Next, the three enzyme fractions were entrapped in alginate beads and the optimal temperature and pH for the conversion of D-galactose to D-tagatose were determined. Experiments were carried out with temperatures ranging from 50 to 90°C at a pH of 7.0. For the optimal pH, experiments were carried out from pH 5.0 to pH 9.0. The D-tagatose concentrations were determined using cysteine-carbazole method. The different immobilised enzyme fractions showed an optimal temperature of 80°C. After 5 hours of incubation at 80°C and pH 7.0, a D-tagatose concentration of 54.2 ± 0.5 g/l, 27.9 ± 1.2 g/l and 36.1 ± 1.0 g/l was obtained for the diluted intracellular enzyme, diluted crude extract and purified enzyme, respectively. The optimal pH was 6.5 for the different beads. After 5 hours of incubation at 60°C and pH 6.5, a D-tagatose concentration of 23.2 ± 0.3 g/l, 10.5 ± 0.3 g/l and 13.2 ± 0.3 g/l was obtained for diluted intracellular enzyme, diluted crude extract and purified enzyme, respectively. The results within this study revealed that intracellular enzyme, crude extract and purified L-arabinose isomerase entrapped in alginate beads have the same optimal operational conditions for the conversion of D-galactose into D-tagatose. An optimal temperature and pH of 80°C and 6.5 were determined for each fraction individually. These findings will be useful for the biological conversion of D-galactose to D-tagatose. This is a first step of a bigger research to improve the productivity and stability of immobilised L-AI from Geobacillus stearothermophilus for the production of D-tagatose.
Analysis of intra-tumoral heterogeneity in context of tissue specific gene expression with computational approach
Identification of tissue-specific genes is essential for understanding molecular mechanisms. Intra-tumoral heterogeneity as diversity among cells and layers of tissues in only one single tumor limits therapeutic efficacy. Tumor heterogeneity is an important challenge for successful personalized medicine. We aimed to identify tissue-specific genes rigorously for examining intersection between differentially expressed genes (DEG) and tissue specific genes, analyzing cancer gene expressions in terms of tissue specificity, demonstration and interpretation of intra-tumoral heterogeneity, revealing specific molecular targets for tumors and elucidating roles of tissue-specific genes in biological processes. Gene expression, derived from five RNA-Sequencing projects, spanning 96 human tissues were used. Detection of tissue-specific genes not only included tau, but also required integrating of tau and statistical distance. This new method is defined as "extended tau". We investigated intersection of 16 different cancer DEG with specifically expressed genes in corresponding tissue. After that, gene expression data for 11 primary solid tumors, retrieved from The Cancer Genome Atlas (TCGA), were analyzed by integrating our tissue specificity findings. Significant genes obtained after all calculations were functionally annotated for identifying their roles. Consequently, we successfully assigned genes to multiple tissues by extended tau. Then discovered that DEG in a cancer tissue has low overlap with genes specific to that tissue. Most importantly, we identified candidate biomarkers for heterogeneity exhibiting gene expression in cancer tissue although its expression is restricted to unrelated tissue. The genes identified in our study were already shown in literature to be associated with tumor heterogeneity or genetic instability of cancer cells for various cancers. Our results are likely to contribute to the road paved by many researchers trying to understand cancer for many years by bringing the tissue-specific genes into the scene.
Boya duyarlı güneş hücrelerinde kullanılmak üzere doğal boya üretimi
Fosil yakıtların tükenmeye başladığı ve çevresel sorunların giderek arttığı günümüzde, yenilenebilir enerji teknolojileri oldukça önemli bir yere sahiptir. Bu anlamda en temel yenilenebilir enerji kaynaklarından birisi güneştir ve güneş enerjisinin elektrik enerjisine dönüştürülmesinde kullanılan fotovoltaik hücreler (PV) hızla geliştirilmektedir. Boya duyarlı güneş pilleri (DSSCs) çevre dostu ve düşük maliyetli olması sebebiyle üzerinde en çok çalışılan sistemlerdendir. Bu çalışmada DSSC sistemlerin yapıtaşlarından biri olan boya duyarlılaştırıcılar için dört farklı alternatif doğal boya kaynağı üzerinde karşılaştırmalı olarak çalışılmıştır. Böğürtlen (Rubus fructicosus), karadut (Morus nigra), yaban kirazı (Prunus serotina) ve frambuaz (Rubus ideaus) ön işlemden geçirilmesinin ardından 40°C'de 60 dakika ultrasonik banyoda ekstraksiyon işlemine tabi tutulmuştur. İşlem sonrasında elde edilen doğal boya ekstraktları vakumlu filtrasyon ve santrifüj ile içerisindeki meyve partiküllerinden arındırılmıştır. Boyaların, kırmızı renk veren en önemli doğal pigmentlerden biri olan antosiyaninler yönünden hangi pH değerinde daha zengin olduğunu belirleyebilmek amacıyla 5 farklı pH değerinde (1-2-3-4-4,5) çalışılmıştır. Hazırlanan boyaların UV-Visible Spektrofotometre ile analizi gerçekleştirilmiş, doğal boya ekstraktları hem pH yönünden hem de kendi içlerinde sahip oldukları pigment yoğunlukları yönünden karşılaştırılmıştır. Her boya için yoğun antosiyanin absorbsiyonunun 520 nm'de pH 1'de olduğu görülmüştür. Pigment yoğunluklarına göre ise boyalar çoktan aza yaban kirazı, böğürtlen, karadut ve frambuaz olarak sıralanabilmektedir. Aynı zaman da elde edilen doğal boyaların yapısal karakterizasyonu için Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FT-IR) ve Raman Spektroskopisi ile de analizleri gerçekleştirilmiştir. Doğal boyaların DSSC sistemlerindeki TiO2 yarıiletkeni yüzeyindeki boyama ve güneş ışığı altındaki solma özelliklerinin incelenmesi için F-katkılı kalay oksit (FTO) ile kaplı transparan cam ve TiO2 karışımı hazırlanmıştır. FTO cam TiO2 kaplanmış ve kaplanan camın TiO2 kısmı ise pH 1'deki dört farklı doğal boya içerisinde 24 saat bekletilmiştir. Boyama özelliklerine göre doğal boyalar sırasıyla; yaban kirazı, böğürtlen, karadut ve frambuaz şeklinde sıralanmıştır. Karadut ve frambuaz oldukça düşük renkler verdiğinden TiO2 yüzeyinde yaklaşık 2 ay kalırken yaban kirazı ve böğürtlen ise yaklaşık 4 ay kalabilmiştir. Sonuç olarak dört meyve arasında incelenen özellikler açısından en iyi sonucu yaban kirazı vermiştir ve DSSC sistemlerinde boya duyarlılaştırıcı olarak ümit veren bir malzemedir.
Bupropion yüklü polilaktik asit ve polilaktik-ko-glikolik asit nanopartiküllerin sentezlenmesi ve kontrollü salımda değerlendirilmesi
Nanopartiküller; boyut olarak hücresel alıma imkan vermeleri, kolay optimize edilebilir olmaları, salım profillerinin kontrol edilebilirliği gibi eşsiz avantajlar sebebiyle ilaç salım sistemlerinde sıklıkla tercih edilmektedir. Doğal polimerlerin, optimizasyon zorlukları nedeniyle yaygın şekilde kullanılamaması, bu alanda sentetik polimerleri daha fazla tercih edilir kılmıştır. Bu çalışmada da sentetik polimerlerden PLGA ve PLA; yüksek biyolojik absorbsiyon kapasitesi, biyouyumluluk, biyobozunurluk, toksik olmama, sürekli ilaç salımına olanak verme ve FDA tarafından onaylanmış polimerler olma gibi önemli avantajları sebebiyle ilaç salım sistemleri olarak belirlenmiştir. Bupropion HCl, sigara bırakma tedavisinde etkin şekilde kullanılan ve etki mekanizması sinir sistemi olan bir dopamin/nöradrenalin geri alım inhibitörüdür. Mevcut ajanlara kıyasla güvenlik ve tolere edilebilirlik avantajları sunan Bupropion HCl çeşitli sinir sistemi hastalıklarının tedavisinde de etki göstermiş bir antidepresan olmakla birlikte günümüzde sigara bırakma tedavisine yönelik kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında istenen özelliklerde üretilen PLGA ve PLA nanopartiküllerine bupropion HCl yüklemesi yapılmıştır. Nanopartiküllerin karakterizasyonu Zeta-Sizer, FT-IR, UV-Vis ve SEM analizleri ile gerçekleştirilmiştir. Bupropion HCl yüklü nanopartiküllerin salım çalışmaları PBS tamponunda kümülatif salım tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İlaç yükleme verimleri ve salım değerleri UV-Vis spektroskopisi ile tayin edilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda ilaç salımının PLGA nanopartiküllerinden 12. günde, aynı miktarda etken madde (5 mg) yüklü PLA nanopartiküllerinden ise 15. günde %100 e ulaştığı görülmüştür. Her iki polimerik nanopartikülün de ilaç taşıyıcısı olarak kullanımının; kandaki etken madde düzeyini kontrol altında tutarak ilaç alım sıklığını azaltacağı ve bu sayede hasta konforunu artıracağı öngörülmektedir. Hem PLGA hem de PLA nanopartiküllerinin birçok antidepresan ilaç için uzun süreli ve kontrollü salımda bir model olabileceği düşünülmektedir.
Graphene oxide/hydroxyapatite nanocomposite scaffolds for tissue engineering
Tissue engineering (TE) provides the development of supporting and structural skeletal material for the regenerative medicine, the most therapeutic strategy of biomedicine. The scaffold can be used in accordance with the clinical requirements for tissue slits or degeneration. These scaffolds provide the materials necessary for the cells through diffusing the matrix, while the cells also hold onto this structure and grow into their own texture. These scaffolds enable the complex kinematic system in the joint to occur during daily activities, carrying the general mechanical response and motion applied forces of the body, and fulfill the unique mechanical properties of critical biomechanical functions, geometry, attachments and scaffolds. GO's superior properties and biocompatibility give a big potential to TE. Recent research has shown that GO promotes cell proliferation and differentiation depending on the high surface area and activates porous 3-D construction. Also the previous studies proved the mechanical property of the GO. In this study, tissue compatibility of scaffolds and different ratios of GO / HA nanocomposite materials performed. Cell culture tests and material characterization were performed and the results were compared with other literature studies. In this comparison, it was observed that the graphene oxide widened the hydroxyapatite surface area and increased cell proliferation. Sinterization is another effect to supply mechanic support. Some characterization tests were performed to develop produced different ratio GO scaffolds. The TEM analysis confirms the presence of the spherical shape morphology of the prepared hydroxyapatite nanoparticle with the particle size of around 30 to 50 nm but DLS particle size was higher than TEM results. Agglomeration is the reason of this differences. Besides, cell culture and characterization tests point out that the GO supports the cell proliferation cell adhesion with the well compatible features. GO increases the specific surface area and it aids to cell penetration and colonization. Therefore the cell- tissue compatibility and the osteogenesis (bone regeneration) was supplied by our GO-HA nanocomposite scaffolds. 0.5 % and 1% GO included scaffolds have perfect proliferation also, the cells seem very healthy. Dapi, Anti vinculin and Dio-6 tests support this result. On the other hand this study illustrates the increased amount of GO help to cell proliferation.
Akut mide mukoza hasarı üzerine Abelmoschus esculentus L.'nın anti-ülser etkisinin araştırılması
Abelmoschus esculentus L.(Malvaceae), geleneksel Türk tıbbında ülser ve gastrit gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılan tıbbi bir bitkidir. Bu çalışmada, Abelmoschus esculentus (L.) ekstraktının(AEE) etil alkol ile oluşturulan akut mide mukozal hasarı üzerine hayvan modellerinde gastroprotektif etkisi incelenmiştir. Bunun için rat modellerinde etil alkol ile ülser oluşturuldu. 24 saat aç bırakılan ratlara 500 mg/kg, 250 mg/kg, 100 mg/kg Abelmoschus esculentus ekstraktı (AEE); 20 mg/kg famodin (Fam); 75 mg/kg quercetin (Que); etil alkol grubuna 1ml etil alkol ve sham grubuna ise izotonik NaCl eşit hacimlerde gavajla verilmiştir. Bir saat sonra tüm ratlar sakrifiye edilerek, mideleri çıkarılmıştır. Mideler büyük kurvatur boyunca kesilerek açılmış ve serum fizyolojikle yıkanmıştır. Mide mukoza lezyonları ile toplam mide alanı ve lezyon alanı hesaplanarak, ülser alanı/toplam mide alanı ülser indeksi olarak ifade edilmiştir. Oksidatif stresin göstergesi olan malondialdehid (MDA) ve redükte glutatyon (GSH) düzeyleri tam kanda ve dokuda; antioksidan özellik gösteren askorbik asit, serum β-karoten ve retinol serumda; Süperosit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ise eritrositlerde ölçülmüştür. Mide doku kesitlerinde mukozal ödem, hemoraji, inflamasyon, epitel hücre erozyonu ve interlökinler (IL-6, IL-1β) değerlendirilmiştir. Bioelement seviyeleri ise homojenize edilmiş dokularda incelenmiştir. Akut toksitite araştırması için farelere 100, 250, 500, 1000, 3000 ve 5000 mg/kg AEE dozları uygulanmıştır. Bu araştırmada herhangi bir tosik etki gözlemlenmemiştir. AEE-500, 250, 100, Fam-20 ve Que-75 sırasıyla 81.0, 67.5, 67.0, 76.3 ve 72.4 % ülser oluşumunu inhibe etmiştir. Tüm çalışma gruplarında MDA düzeyleri etil alkol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak azalmıştır (p<0.001). AEE-500 grubunda β-karoten ve retinol düzeyleri sırasıyla anlamlı olarak % 40.2 ve % 45.4 artmıştır. GPx seviyesinin AEE-500 mg/kg uygulanan grupta en yüksek olduğu ve bu değerin sham grubu ile yakın olduğu görülmüştür. AEE-100 ve 500 mg/kg uygulan gruplarda SOD değerleri etil alkol grubuna göre daha yüksektir (p<0.001 ve p<0.01). CAT sonuçları değerlendirildiğinde AEE-250 ve 500 mg/kg grupları etil alkol grubuna göre istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0.01). Antioksidan enzimlere paralel olarak Cu, Zn, Fe, Se ve Ca bioelement seviyeleri de etil alkol grubu ile kıyaslandığında anlamlı bir artış görülmüştür. AEE-500 grubu, etil alkol grubuna kıyasla ödem, kanama ve inflamasyon skorlarını önemli ölçüde azaltmıştır (p<0.05). AEE-500, 250 ve Fam-20 gruplarında apoptoz azalmış (p<0.001) ve etil alkol grubuna kıyasla daha yüksek bir pozitif hücre oluşumu gözlemlenmiştir (p<0.001). Özellikle AEE-500 mg/kg uygulanan gruplarda IL-6, IL-1β seviyelerinin etil alkol grubuna göre önemli derecede azalmıştır. Çalışma sonunda biyokimyasal ve histopatolojik veriler değerlendirildiğinde Abelmoschus esculentus L. ekstraktının (AEE) etil alkolle indüklenen gastrik hasar üzerine gastroprotektif bir etkiye sahip olduğu kanısına varılmıştır.
Bronkopulmoner displazi ile ilişkilendirilen belirli genlerdeki polimorfizmlerin Türk populasyonu üzerinde incelenmesi
Bronkopulmoner displazi (BPD), preterm infantlarda en sık görülen kronik akciğer hastalıklarından biridir. Merkezlerin kronik akciğer hastalığı ve BPD tanımlarının farklılıklarından dolayı BPD insidansı da merkezlere göre değişkenlik gösterse de çoğu Avrupa ülkesine göre, hamileliğin 30. haftasından önce doğan preterm infantların %30'undan fazlasına BPD teşhisi konmaktadır. BPD geliştirme eğilimi olan preterm infantlar, akciğer gelişiminin geç kanaliküler veya erken sakküler evresinde doğarlar ve sonuçta alveol sayıları matür bebeklere göre daha az olur. Günümüzde enflamasyon ve özellikle prematürite ile birlikte alveol gelişimindeki duraklama, sürfaktan eksikliği ve göğüs duvarının olgunlaşmaması BPD'nin en önemli etiyolojik faktörleri olarak görülmektedirler. BPD, genetik ve çevresel faktörlerin (hiperoksi, invazif mekanik ventilasyon ve sepsis) karşılıklı etkileşimi sonucunda meydana gelmektedir. Literatürde BPD riskine etki eden genetik faktörler ikiz çalışmaları, ailesel birikim, genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (genome wide association studies, GWAS) ve hedef genlerde tek nükleotid polimorfizmleri (single nucleotide polymorphism, SNP) gibi farklı yaklaşımlar ile araştırılmaktadır. Bu tez çalışmasında, dünyada farklı populasyonlar üzerinde yapılmış çalışmalarda bronkopulmoner displazi (BPD) ile ilişkilendirilmiş bazı SNP'ler seçilerek, Türk populasyonunda da bu SNP allel ve genotip frekanslarının görülüp görülmediğinin multipleks reaksiyonlar ve MALDI-TOF kütle spektrometrisi yöntemi ile belirlenmiştir. Elde edilen veriler ayrıca hastaların klinik ve demografik bilgileri ile de karşılaştırılarak anlamlı bir ilişki kurulmaya çalışılmış ve BPD'nin Türk toplumuna özgü genetik tabanının anlaşılabilmesine katkıda bulunulması amaçlanmıştır. 96'sı BPD hastası, toplam 192 prematüre infanttan toplanan kan örneklerinden genotiplenen 45 SNP bölgesi arasından rs11003125, rs2233406, rs3138053, rs55716084 ve rs62468577 polimorfizmlerinin allel düzeyinde; rs4883955, rs833061 ve rs9953270 polimorfizmlerinin ise hem allel hem de genotip düzeyinde Türk populasyonunda BPD insidansı ile istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki içerisinde olduğu saptanmıştır. Bununla birlikte hastalardan toplanan klinik ve demografik verilerin araştırılan SNP'ler ile olan ilişkileri incelendiğinde ise pek çok polimorfizmin ailede görülen kronik akciğer, zatürre, BPD, RDS ve sigara kullanımı öyküsü ile anlamlı bir ilişki içerisinde olduğu bulunmuştur. Sonuç olarak bu tez çalışması ile toplumumuz için ilk kez BPD hastalığının genetik altyapısının araştırılması amacıyla çoklu polimorfizm bölgeleri yüksek doğruluk ile genotiplenerek BPD insidansı ile ilişkileri ortaya konmuştur.
Yeşil sentez ile elde edilen metal nanopartiküllerin antimikrobiyal ve antibiyofilm etkinliklerinin değerlendirilmesi
Nanoteknoloji alanındaki son gelişmeler, nano boyuttaki yapıların artan yüzey alanı ve sahip oldukları birçok farklı özellik nedeniyle günümüzde dikkat çekmektedir. Nanopartikül (NP) araştırmaları, bilim dünyasını dönüştürmeye katkıda bulunan çalışma alanlarına olağanüstü katkılar sağlamaktadır. NP'ler; tüketim ve endüstriyel ürünlerde uygulama alanı bulurken, benzersiz özellikleri ile çok önemli değişikliklere yol açacak ölçüde teknolojiyi geliştirmeye devam etmektedir. Ancak, NP'lerin artan üretimi, bunların kullanımı veya çevrede istenmeyen bir şekilde serbest bırakılmaları, tüketici ve çevre güvenliğini sağlayan süreçlere ve politikalara duyulan ihtiyaçları ortaya çıkarmaktadır. NP'lerin potansiyel olarak güvenli bir şekilde hazırlanması ve güvenli kullanım yöntemlerini bir araya getirdiğimizde oluşabilecek herhangi zararlı bir etkinin ortadan kaldırılması mümkün olacaktır. Farklı biyolojik yöntemler kullanılarak NP'lerin biyosentezi, farklı disiplinlerdeki sayısız uygulamalar için etkin olmaktadır. NP'lerin sentezi için farklı yaklaşımlar (fiziksel ve kimyasal) kullanılmasına rağmen, yeşil sentez yöntemi yüksek etkinliği, maliyet etkinliği ve çevresel faydası nedeniyle en çok tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Yapılan tez çalışması kapsamında; bitki ekstraklarını kullanarak gümüş (AgNP), bakır oksit (CuONP) ve demir oksit (FeONP) NP'lerinin sentezinin ve karakterizasyonun gerçekleştirilmesi ve bu yolla sentezlenen NP'lerin biyolojik aktivitelerinin ortaya çıkarılması temel hedef olarak belirlendi. Ayrıca metalik NP'lerin boyutunun ve şeklinin, sentezde kullanılan bitki ekstrakt kaynağının NP'lerin göstermiş oldukları antimikrobiyal ve antibiyofilm etki başta olmak üzere çeşitli biyolojik aktivitelerindeki rollerinin belirlenmesi de çalışmanın temel hedeflerinden birini oluşturmaktadır. Bu amaç doğrultusunda; AgNP, CuONP ve FeONP farklı konsantrasyonlardaki Thymbra spicata L. var. spicata (Zahter) sulu yaprak ekstraktları kullanılarak oda sıcaklığında yeşil sentezle ile elde edildi. Cynara scolymus (Enginar) ve Mentha piperita (Nane) yaprak ekstraktları AgNP sentezinde kullanarak, ekonomik öneme sahip olan üç bitkinin yaprak özütleri aracılığı ile sentezlenen NP'lerin biyolojik aktiviteleri karşılaştırmalı olarak incelendi. NP'ler farklı spektroskopik ve mikroskobik analiz yöntemleri kullanılarak karakterize edildi. Sonuç olarak; bitki ekstraktları kullanılarak sentezlenen AgNP'lerin TEM analizi, AgNP'lerin boyut ve şeklinin bitki ekstraktı konsantrasyonu ile kontrol edilebileceğini ortaya çıkardı. TEM sonuçlarına göre T. spicata yaprak ekstrakt konsantrasyonunun arttırılması ile ortalama AgNP partikül çapının 70.2 nm'den 25.1 nm'ye düştüğü gözlemlendi. Ayrıca, TEM ile yapılan boyut analizlerine göre CuONP ve FeONP'lerin ortalama partikül çapının 25 ve 100 nm civarında olduğu tespit edildi. Aynı zamanda farklı tekniklerle NP'lerin boyut analizi incelendiğinde NP boyutunun DLS>AFM>TEM>XRD olarak sıralandığı ortaya çıktı. Üç farklı bitkinin yaprak ekstraktları kullanılarak sentezlenmiş AgNP'ler, iki farklı gram-negatif ve gram-pozitif bakteri karşısında antibakteriyel etkinlikte önemli farklılıklar sergiledi. C. scolymus yaprak ekstraktından elde edilen CsAgNP'lerin S. aureus'a karşı 18.53 mm çapında maksimum inhibisyon zonu ve 12.5 µg/mL MİK değeri ile en fazla antibakteriyel aktivite gösterdiği belirlendi. S. aureus için yapılan antibiyofilm aktivite çalışmasında sentezlenen NP'lerin antibiyofilm etkinlikleri belirlendi. Ayrıca, T. spicata yaprağı ekstraktını kullanarak sentezlenen AgNP'lerin antibakteriyel ve sitotoksik aktivitelerinin şekil bağımlı olduğu gösterildi. Yapılan tez çalışmasında, farklı şekillerdeki NP'leri bünyesinde barındıran örnekler, çoğunlukla küresel formda NP'lere sahip örneklere göre güçlü antibakteriyel ve sitotoksik aktivite sergiledikleri gözlemlendi. Elde edilen sonuçlar, AgNP'lerin biyolojik aktivitelerinin NP şeklinden ve sentezde kullanılan bitki ekstrakt kaynağından etkilendiğini ortaya koymaktadır. Ayrıca T. spicata yaprak özütü kullanılarak sentezlenen CuONP ve FeONP'lerin antimikrobiyal, antibiyofilm, antioksidan ve sitotoksik etkinlikleri değerlendirildi. Elde edilen sonuçlara göre, FeONP'lerin en az AgNP'lerin ise en fazla antibakteriyel aktivite gösterdiği gözlemlendi.
(E)-1-(2,2-dikloro-1-fenilvinil)-2-fenildiazen yüklü kitosan nanopartiküllerin sentezi ve kontrollü salımda değerlendirilmesi
Nanopartiküller çeşitli özgül özelliklerinden dolayı son yıllarda tıp ve nanoteknoloji alanlarında peptid ve protein taşınması, ilaç hedefleme ve kontrollü ilaç salım teknolojisi gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmaktadır. Nanopartikül sentezinde yaygın olarak kullanılan doğal polimerlerden biri kitosandır. İyi derecede biyouyumluluğu, biyobozunurluğu ve eşsiz katyonik özelliği sayesinde kitosan, nanopartiküler taşıyıcı sistemlerde sıklıkla tercih edilmektedir. (e)-1-(2,2-dikloro-1-fenilvinil)-2-fenildiazen katalitik olefinasyon reaksiyonu gerçekleştirilerek sentezlenen yüksek fizyolojik aktiviteye sahip yeni organik bir bileşiktir. Molekülün antimikrobiyal aktivitesi S. aureus, P. aeruginoza, E.coli ve C. albicans gibi mikroorganizmalar üzerinde araştırılmıştır. Buna ilave olarak furacilin ve nitofungin gibi yaygın olarak kullanılan ilaçlarla ve etil alkol ile antimikrobiyal aktivitesi kıyaslanmış olup güçlü antibakteriyel ve antifungal özellik gösterdiği kanıtlanmıştır. Bu tez çalışmasında antibakteriyel ve antifungal özelliğe sahip yeni organik bir bileşik olan (e)-1-(2,2-dikloro-1-fenilvinil)-2-fenildiazen molekülünün biyouyumlu ve biyobozunur kitosan nanopartiküllerine yüklenerek biyouyumluluğunun, biyoyararlanımının arttırılması ve sentezlenen nanopartiküler sistemden molekülün kontrollü salımının incelenmesi amaçlanmıştır. Sentezlenen nanopartiküllerin zeta potansiyel ve partikül boyutları Zeta Sizer cihazı kullanılarak ölçülmüş, karakterizasyonu için FT-IR, UV-VIS ve SEM analizleri gerçekleştirilmiştir. Nanopartiküllerin enkapsülasyon etkinliği, yükleme kapasitesi ve reaksiyon verimi hesaplamaları yapılmış, salım çalışmaları ise PBS tamponunda kümülatif salım tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda istenilen özelliklerde optimum nanopartiküller elde edilerek, ilaç salım çalışmaları gerçekleştirilmiş ve 30 günün sonunda salım değerlerinin %38 – 58 aralığında değiştiği tespit edilmiştir. Sentezlenen polimerik nanopartiküllerin ilaç taşıyıcısı olarak kullanımının kandaki etkin madde seviyesini kontrol ederek doz uygulamasını azaltacağı dolayısıyla hasta uyumluluğunu arttıracağı öngörülmektedir. Buna ilave olarak sentezlenen nanopartiküllerin benzer antimikrobiyal özellik gösteren moleküller için uzun süreli ve kontrollü salımda model olabileceği düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: nanopartikül, kitosan, (e)-1-(2,2-dikloro-1-fenilvinil)-2-fenildiazen, ilaç salımı
Development of recombinant oncolytic Coxsackievirus B3 for treatment of colorectal carcinoma
Colorectal cancer is one of the most death related cancer type in worldwide. Conventional cancer therapeutics show curable effect only in the patients at early stage of the disease. In case of the diagnosis at late stages, the survival rate decreases dramatically up to 10%. Therefore, novel cancer therapeutics are urgently needed. Oncolytic virotherapy is a new treatment approach which exploits the viruses against cancer. Clinical trials prove the efficiency of various oncolytic viruses in treatment of different tumors. Coxsackievirus B3 (CVB3), a single-stranded RNA virus of the picornavirus family, has been described as a novel oncolytic virus against lung carcinoma. However, CVB3 can induce severe diseases, such as pancreatitis, myocarditis and encephalitis, but the course of infections is decisively influenced by the particular strain of CVB3. In this thesis, firstly, it was aimed to investigate different laboratory strains of CVB3 (Nancy, 31-1-93, H3) which use the coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) and the strain PD which uses N- and 6-O-sulfated heparin sulfate (HS) for entry into colorectal tumor cells, for their potential to lyse these cells and for their safety profile. In vitro investigations showed variable infection efficiency and lysis of colorectal carcinoma cell lines by the CVB3 strains. The most efficient strain was PD, which was the only one that could lyse all five of the investigated colorectal carcinoma cell lines. Lytic activity of CAR-dependent CVB3 did not correlate with CAR expression on colorectal carcinoma cells, whereas there was a clear correlation between lytic activity of PD and its ability to bind to HS at the cell surface of these cells. Intratumoral injection of CVB3 Nancy, 31- 1-93 or PD into subcutaneous colorectal DLD1 tumors in BALB/c nude mice each resulted in strong inhibition of tumor growth. The effect was seen in the injected tumor, as well as in a non-injected, contralateral tumor. However, all animals treated with 31-1- 93 and Nancy developed systemic infection and died or were moribund and sacrificed at 6 and 8 days post intratumoral virus injection. In contrast, five of the six animals treated with PD showed no signs of a systemic viral infection and PD was not detected in any organ. These results indicate that PD has potential to be a potent and safe oncolytic CVB3 strain for use in the treatment colorectal carcinoma. To increase the tumor selectivity, so that to abolish the possibility of undesirable virus infection in healthy organs, target sites of pancreas-specific microRNA was inserted into the virus genome and recombinant CVB3 was analyzed in vitro and in vivo. Detargeting of the pancreas, which is the most susceptible tissue for CVB3 infection, by exploiting miRNAs, increased the survival rate of treated animals significantly. The virus was unable to replicate in the pancreas and all animals survived. In contrast, colorectal carcinomas were destroyed as efficient as the wild-type CVB3. Finally, it was aimed to increase the efficiency of CVB3 against infection resistant colorectal cancer cell line by using directed evolution strategy. Results showed that CVB3 can specifically adapted to colorectal carcinomas leading to breaking the resistance of the tumor cells against CVB3 infection.
Hidroponik sistemde besleyici film tekniği ile yüksek boylu maviyemiş ( Vaccınıum corymbosum L. ) yetiştirilmesi ve yetişme şartlarının optimize edilmesi
Bu çalışma, dünyada 1905 yılında kültüre alınan, özellikle Karadeniz bölgesi iklimine ve toprağına uyum sağlama potansiyelinden dolayı 2000li yıllarda Türkiye'de yetiştirilen ve üretimi devlet tarafından da teşvik edilen blueberry (maviyemiş) bitkisinin topraksız tarım hidroponik sistemde yetiştirilmesi ve yetişme koşullarının optimize edilmesini içermektedir. Yıldız Teknik Üniversitesi Kimya Metalurji Fakültesi Biyomühendislik bölümüne ait biyoteknolojik serada Mart 2015-Eylül 2015 ayları arasında yürütülmüştür. Araştırmada bitkisel materyal olarak yüksek boylu maviyemiş (Vaccinium corymbosum) türlerinden bluecrop tercih edilmiştir. Maviyemiş yetiştirilirken topraksız tarım hidroponik sistem metotlarından biri olan NFT (Nutrient Film Tecnique, Besleyici Film Tekniği) kullanılmıştır. Hidroponik sistem için 4 m uzunluğunda 40 adet tava, pompa, 8 tonluk 1 adet besleme tankı kullanılmıştır. Ortalama 1.5 m mesafe ile 95 adet maviyemiş dikilmiş, strafor köpükle sabitlenmiştir. Besin çözeltisi hazır alınmamıştır belli tuzlar ile hazırlanarak optimum besin çözeltisi elde edilmeye çalışılmıştır. Kullanılan tuzlar ve miktarları şöyledir: Amonyum Nitrat (NH4NO3) 437.5 ppm, Kalsiyum Nitrat (Ca(NO3)2. 4H2O) 962.5 ppm, Potasyum Nitrat (KNO3) 210 ppm Magnezyum Sülfat (MgSO4.7H2O) 437.5 ppm, Monopotasyum Fosfat (KH2PO4) 262.5 ppm, Demir Sülfat (FeSO4.7H2O) 6.75 ppm, Mangan Sülfat (MnSO4) 5.875, BORAX (Na2B4O7.10H2O) 9 ppm, Bakır (II) Sülfat (CuSO4) 8.75 ppm, Çinko Sülfat (ZnSO4) 11.25 ppm, Kobalt Sülfat (CoSO4) 7.5 ppm. Bu miktarlarda ölçülen pH değeri 7.1 dir. Asit (H2SO4) ile müdahale edilerek pH düşürülmüştür. İkinci kez hazırlanan besin çözeltisinde ise yapraklarda oluşan klorozun Mg ve K eksikliğinden olabileceği düşünülerek Kalsiyum Nitrat %20 artış ile 1155 ppm, Potasyum Nitrat %10 artış ile 231 ppm, Monopotasyum fosfat %10 artış ile 288.75 ppm olarak ayarlanmıştır. Bu değerlerdeki pH değeri ise 3 tür. Baz (KOH) ile müdahaleyle pH yükseltilmiştir. Maviyemiş yetişmesinde optimum pH aralığı 4.5- 5 olduğu için, pH devamlı olarak asit veya baz ilavesi ile sabit tutulmaya çalışılmıştır. Asit olarak H2SO4, baz olarak KOH kullanılmıştır. Besin çözeltisi stok olarak hazırlanmış günlük 1 l tanka besin çözeltisi ve 0.5 ton su eklenmiştir. Araştırma süresi boyunca bitki boy uzaması, yaprak rengi, yaprak sayısı, meyve sayısı seçilen 10 örneklem üzerinden takip edilmiştir. Bitkileri yüksek yaz sıcaklarından korumak için sera tavanında perdeleme yapılarak hem sera ortam sıcaklığı düşürülmüş hem de bitki gölgelenme isteği karşılanmıştır. Bitki boy uzamasına baktığımızda 5 ayda toplam 9 cm uzamıştır. Bu uzama Nisan 1. yarı ile Temmuz 2. yarı arasında olmaktadır. Topraklı tarımda iki yıldan daha kısa sürede meyve alımı mümkün değilken hidroponik serada 5 ay sonunda meyve alınmıştır. Maviyemiş meyveleri ilk olarak Ağustos ayında oluşmuştur. Ortalama meyve ağırlığı 2-3 g'dır.
Prostat kanserinin tanısında kullanılmak üzere prostat kanser antijen 3 temelli non invaziv kit geliştirilmesi
Prostat kanseri, erkeklerde en sık görülen kanser türlerinden biridir. Prostat kanserinin tanısı için hastaya uygulanan biyopsinin zahmetli ve rahatsız edici olmasından dolayı teşhis için biyobelirteçler kullanılmaktadır. Serum örneğinde Prostat Spesifik Antijen (PSA) tespiti prostat kanserinin tanısında en sık kullanılan invaziv olmayan bir yöntemdir. Fakat söz konusu yöntem hassaslık ve özgünlük açısından zayıf kalmaktadır. Bu araştırmanın amacı, prostat kanseri tanısında serum PSA seviyesine alternatif olarak idrarda Prostat Kanser Antijen 3 (PCA3) mRNA'yı tespit etmek için hassaslık ve özgünlük değerleri yüksek yeni bir kit geliştirmektir. Kartal Eğitim ve Araştırma Hastanesi'ne başvurmuş yaşları 55-70 arasında olan 82 vakanın rektal muayenelerinden sonra serum PSA değerleri ölçülmüş ve ardından biyopsi ile prostat kanseri varlığı araştırılmıştır. Çalışmaya alınan kişilerden 64'ü prostat kanseri ve 18'i sağlıklı bireylerdir. Bu vakalardan toplanan idrar örneklerinde PCA3 ekspresyon (mRNA) düzeyi, Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonuna (RT-PZR) dayanan geliştirdiğimiz kit ile tespit edildi. Ardından bu PCA3 seviyeleri PSA ve biyopsi sonuçları ile karşılaştırıldı. PCA3 mRNA seviyeleri ile altın standart olan biyopsi sonuçları karşılaştırıldığında testin hassaslığı %63, özgünlüğü %100, pozitif öngörüsel değeri (PPV) %100 ve negatif öngörüsel değeri (NPV) %43 olarak bulunmuştur. Analiz bulguları neticesinde, biyopsi sonucunda prostat kanseri teşhisi konan hasta grubunda PCA3 ekspresyonu görülme sıklığı %63 iken (n=40) sağlıklı grupta hiç gözlenmemiştir. Hasta grubu ile sağlıklı grup arasında PSA değeri ortalamalarının istatistiksel düzeyde anlamlı olarak farklılık gösterdiği belirlenmiştir (p<.001). Buna göre hasta grubunda PSA seviyesinin, sağlıklı gruba kıyasla daha yüksek olduğu bulunmuştur. Negatif öngörüsel değer, test ile sağlıklı olduğu belirlenen bireylerin gerçekten sağlıklı olma yüzdesini ifade eder. Dolayısıyla bu çalışmada PCA3 seviyesine göre sağlıklı tespit edilen 42 bireyden 18 bireyin gerçekten sağlıklı olup olmadığı biyopsisi alınmadan anlaşılamamaktadır. Geliştirdiğimiz PCA3 tespit kiti, prostat kanserini tek başına tespit etmede yeteri kadar hassas bulunamamıştır. Fakat bu kitin sonuçlarının, PSA ve biyopsi sonuçları ile birlikte değerlendirilmesi anlamlı görülmüştür.
İmmünobiyosensörlerde biyomoleküllerin dedeksiyonu için immobilizasyon yöntemlerinin geliştirilmesi
Biyosensörler, bir biyolojik algılayıcı ile hedef analitin arasındaki etkileşimin yarattığı değişiklikten sinyal üreten bir transdüserin kombinasyonundan oluşan cihazlardır. Biyosensörlerin performans parametreleri; hızlı geriye dönme zamanı, dinamik cevap, tekrarlanabilirlik, seçicilik, kantitatif ölçüm sınırı, tespit sınırı, geniş ölçüm aralığı, doğrusallık ve hassasiyetdir. Biyosensörlerin hassasiyetine büyük ölçüde etki eden immobilizasyon etkinlikleri biyoalgılayıcı yüzeyde farklı methodlar ile gerçekleştirilmektedir. Tez kapsamında yapılan çalışmada elektrod yüzeyinde kendiliğinden oluşan tek tabakalar (self assembled monolayer (SAM)) oluşturularak analit immobilizasyonları gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasında geliştirilen kuvars kristal mikrobalans (QCM) immünosensöründe immobilizasyon etkinliğinin belirlenmesi çalışmaları için Fumonisin (FUM) biyomolekülü model olarak kullanılmıştır. FUM, Fusarium Moniliforme ve Fusarium Proliferatum isimli küf mikroorganizmaları tarafından üretilen bir mikotoksin türüdür ve diğer mikotoksinler gibi ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) , Avrupa Komisyonu (E.C.) ve ülkemizde Türk Gıda Kodeksi tarafından getirilen regülasyonlar (düzenlemeler) ile izlenmektedir. FUM kontaminasyonunda laboratuvar odaklı enstrümantal analitik sistemler ile tayinlerin yanısıra yerinde tespit imkanları sunmasına bağlı olarak biyosensörler ile tayin metodları üzerine çalışmalar da geliştirilmektedir. Tez kapsamında FUM'ne karşı üretilen Monoklonal Antikorlar (Mab) kullanılarak FUM dedeksiyonu yapabilen QCM immünosensörü ilk kez geliştirilmiştir. Çalışmada immobilizasyon etkinliğinin önemini ortaya koyan stratejiler sayesinde regülasyonların belirlediği aralıklarda FUM tayini yapılabilen bir sensör geliştirildi. FUM'nin yüzeye immobilizasyonunda SAM ajanı olarak en sık kullanılan 11-merkaptoundekanoik asit'in yanısıra yine lineer ajanlardan 11-merkaptoundekanamid (MUD) ve 11-merkaptoundekanol (MUO) kullanılarak yüzey modifikasyonları yapıldı. İmmobilizasyon etkinliğinin arttırılmasında lineer ajanlara alternatif olarak; kendiliğinden SAM oluşturmaları, farklı topografik yapıları ile analiti sunma/yakalama kabiliyetleri ve yüksek derecede ıslanabilme özelliklerinden dolayı dendronlar kullanıldı. İmmobilize olan analitin elektrodlara ve birbirlerine olan uzaklıklarının ölçümlerdeki hassasiyet üzerine etkisinin belirlenmesi amacıyla 3 farklı nesilden (jenerasyon) dendronlar kullanıldı. Bu amaçla bis-MPA dendron-8-hidroksil-1thiol (G3 DND), bis-MPA dendron-16 hidroksil-1 thiol (G4 DND) ve bis-MPA dendron-32 hidroksil-1 thiol (G5 DND) dendronları ile FUM immobilizasyonları gerçekleştirildi. Yüzeyde dendronların kullanılması ile yüksek sensör yanıtlarının elde edilmesine karşın verilerde güven sınırlamasından dolayı iki katmanlı sensör yüzeyleri oluşturuldu ve MUD ile SAM oluşturulduktan sonra yüzeyde ikinci bir katman olarak dendronlar kullanıldı. Geliştirilen tüm elektrod yüzeyleri ölçümlerde algılama, hassasiyet, doğruluk ve tekrarlanabilirlik parametreleri açısından irdelendi. Biyosensörlerde immobilizasyon etkinliğini ortaya koyan bu çalışmalar sayesinde, 0.008 ppm algılama limitine sahip, güvenilir, tekrarlanabilir, yüksek hassasiyette FUM ölçümü yapabilen QCM immünosensörü geliştirildi.
Performance comparison of membrane bioreactor with dynamic membrane bioreactor
Membrane bioreactors (MBRs) used for wastewater treatment have begun to be used at an increasing rate in developed and developing countries in the last 10 years. It is anticipated that many conventional wastewater treatment plants will convert to the MBR technology in the coming years, and as a result, the final sedimentation basins will come to an end. MBRs are biological processes in suspension growth mode in which purified water and biomass are physically separated by membrane equipment. However, membrane costs, increased energy demand, clogging control and low flow bioreactor operating problems are among the major problems faced by membrane bioreactor systems. Dynamic membrane bioreactor systems (DMBR), due to its low operating cost, have provided a promising approach to solving these problems. The purpose of this study is to measure the pollution performance of two different membrane types, 0.45 μm and non-woven dynamic membranes, which are operated in the same aerobic membrane bioreactor (AeMBR) and fed with synthetic wastewater. During reactor operation, parameters of COD, turbidity, pH, temperature, electrical conductivity (EC), TMP, SADm and ORP were measured daily. The highest COD removal values were found to be 99.47% and 97.02% and the lowest turbidity values were found to be 0.12 NTU and 1.23 NTU for 0.45 µm real and non-woven dynamic membrane, respectively. The maximum and minimum permeate pH values of the AeMBR operated at room temperature, for 0.45 µm real and non-woven dynamic membrane, were found to be 7.98-7.94 and 7.37-7.43, respectively. The maximum and minimum values for electrical conductivity were measured as 574-577 μS and 470-471 μS, respectively, as 0.45 μm real and non-woven dynamic membrane. As a result of the TMP measurements, both membrane materials were subjected to chemical washing (1 hour 0.5% NaOCl and then 1 hour pH = 2 set in tap water) with the pressure rising 300 mbar or above. It is noted that in the measurements made after washing, the membranes acted as if they were used for the first time in operation. In the ORP measurements made in the reactor, the maximum and minimum values were measured as 177.4 and 114.2 for 0.45 µm real and non-woven dynamic membrane, respectively. Also, soluble microbial products (SMP) / extra polymeric substances (EPS), specific resistance to filterability (SRF) / supernatant filterability (SF), fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), capillary suction time (CST), scanning electron microscopy (SEM) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis were included in this study. The study consisted of three experimental periods and on the first day of each experimental period, a new membrane was placed in the module. The first experimental period was successfully operated at 10 LMH flux. During this time, approximately 98% COD removal and 1 NTU turbidity values were measured for both membrane types. During operation, the membranes exhibiting high filtration performance with only physical washing were subjected to chemical washing only once, with the pressure reaching 300 mbar and above. During the first experimental study, once in a week SMP / EPS and only once SEM, SRF / SF, CST, FT-IR and DGGE analysis were performed. In the second period of the experimental run, the flux was increased to 15 LMH and the reactor was run successfully. The average COD removal efficiencies in percentage for 0.45 µm real and non-woven dynamic membrane were recorded as 97% and 90%, respectively. However, physical and chemical washing was applied to both types of membranes against the fouling problems originating from the high flux. The chemical washout was reduced by 97% of the membrane flocking for both membrane types. After chemical washing, the turbidity values of the 0.45 µm real membrane did not change much (around 0.2 NTU) but the turbidity values of the non-woven dynamic membrane gave high values until the cake layer was formed after washing. Minimum turbidity values were found to be between 1-2 NTU for the non-woven dynamic membrane. During the second experimental period, once in a week SMP/EPS and only once SRF/SF and CST were performed and the results compared with the previous experimental period. In the last experimental period, the flux was increased to 20 LMH, during which time the non-woven dynamic membrane fouled swiftly and thus did not perform a successful filtration process. While the turbidity values of the non-woven dynamic membrane layer reached approximately 8 NTU levels, the turbidity values of the 0.45 µm real membrane remained at about 0.2 NTU. Both membranes reached a TMP of approximately 10 mbar as a result of chemical washing which means 97% of the fouling reduction. During the last experimental period, only once SMP/EPS, SRF/SF, CST, FT-IR and DGGE analyses were performed and the results were compared with the other analyses. As a result of FT-IR analysis, organic pollutants on the sludge have been assigned on the graph and for the SEM analysis, organic substances on the membrane were identified, thickness of the cake layer formed on the membrane was measured by cross-sectional image, and the types of micro-contamination causing the fouling were observed and significant information was obtained. Within the DGGE study, the numbers of bacterial species in the sludge that cause fouling were determined. Findings in this study showed that the use of DMBR is very low in terms of cost compared to MBRs and is at least as successful as MBRs in terms of functionality. Based on this information it is expected to shed light on DMBR and MBR studies to be made in the future and also benefit on the use of DMBR in real scale installations.
Mikrobiyal hücre tabanlı ve hücre dışı PET degradasyonsistemlerinin geliştirilmesi ve karşılaştırılmalı analizi
Plastikler, çok yönlü kullanım alanları ve düşük üretim maliyetleri nedeniyle modern endüstride yaygın olarak kullanılmakta olup, PET özellikle tek kullanımlık ambalajlarda en sık tercih edilen polimerlerden biridir. Çevrede biriken PET atıklarının biyolojik olarak parçalanabilmesi için ester bağlarını hidrolize eden mikroorganizmalar giderek daha fazla tanımlanmaktadır. Bu çalışmada, çevreye yaygın şekilde dağılan ve doğada zor parçalanan polietilen tereftalat (PET) atıklarının biyolojik yollarla parçalanabilirliğini değerlendirmek amacıyla hem hücre tabanlı hem de hücresiz (cell-free) sistem kullanılmıştır. Çalışmanın temel amacı, farklı sistemlerdeki PET degradasyon verimlerini karşılaştırmak ve elde edilen ürünleri kantitatif ve kalitatif olarak analiz ederek sistemlerin etkinliğini moleküler düzeyde ortaya koymaktır. Deneylerde yüksek kristaliniteye sahip (% >30) 5 mg PET kullanılmış, hücreli sistemde 48 saat sonunda %1,29'luk bir degradasyon oranı ile yaklaşık 0,333 mM TPA ve 0,0007 mM EG üretimi gözlemlenmiştir. Hücresiz sistemde ise aynı miktardaki PET, 24 saatlik sürede %5,39 oranında parçalanmış; 1,199 mM TPA ve 0,0042 mM EG üretimi tespit edilmiştir. HPLC analizleri ve HOTP floresan sonuçları TPA oluşumunu doğrularken, SEM görüntüleri özellikle hücresiz sistemde PET yüzeyinde belirgin morfolojik bozulmalar olduğunu göstermiştir. İstatistiksel analizler, iki sistem arasında elde edilen ürün miktarlarında anlamlı farklılıklar olduğunu ortaya koymuş (p<0,05) ve hücresiz sistemin verimliliği yaklaşık 4,2 kat daha yüksek bulunmuştur. Bu fark, hücresiz sistemde enzimlerin doğrudan ve daha kontrollü bir ortamda çalışabilmesi, metabolik yan etkilerden arındırılmış bir sistem kullanılması ve ortam koşullarının daha hassas şekilde optimize edilebilmesiyle ilişkilendirilmiştir. Elde edilen bulgular, cell-free sistemlerin PET biyobozunumu açısından daha yüksek verim ve hız sunduğunu göstermiştir. Bu durum, enzimlerin inhibitör etkilerden uzak, daha kontrol edilebilir koşullarda çalışabilmesiyle doğrudan ilişkilidir. Öte yandan hücreli sistemlerin avantajı uzun süreli enzim üretimi potansiyeline sahip olmaları olsa da, hücresel metabolizmanın oluşturduğu kısıtlamalar nedeniyle bu sistemlerde degradasyon etkinliği sınırlı kalmıştır. Çalışma genelinde elde edilen veriler, cell-free platformların plastik atıkların biyolojik dönüşümünde ileri düzeyde mühendislik yaklaşımlarıyla daha da geliştirilerek endüstriyel ölçekte uygulanabilirliğe ulaşabileceğini ortaya koymaktadır. Bu bağlamda, sürdürülebilir plastik geri dönüşümüne katkı sağlamak amacıyla cell-free sistemlerin daha detaylı araştırılması ve optimizasyonuna yönelik çalışmaların artırılması gerekmektedir.
Botanik hava filtrasyon sisteminde mikroçoğaltım yöntemi ile elde edilen ficus elastica roxb. bitkisi kullanılarak kapalı ortam havasındaki uçucu organik bileşiklerin (toluen ve etanol) uzaklaştırılması
Uçucu organik bileşikere (UOB) maruz kalmanın insan sağlığı açısından olumsuz etkileri yapılan araştırmalarla ortaya konmuştur. İç ortam havasında bulunan UOB'ler giderilmediği durumlarda ciddi sağlık sorunlarına sebep olmaktadır. Bu bileşiklerin giderilmesinde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bunlardan birisi de botanik biyofiltrasyon sistemleridir. Bu sistemler sürdürülebilir, toksik olmayan, ucuz, çevre dostu ve verimli olması nedeniyle üzerinde durulması gerekmektedir. Bu tez çalışmasında Ficus elastica bitkisi ile oluşturulan botanik hava filtrasyon sisteminde toluen ve etanol UOB'lerinin uzaklaştırılma verimleri; bileşik konsantrasyonu, bağıl nem, süre değişkenleri kullanılarak optimize edilmiştir. Mikroçoğaltılmış bitkilerle, optimum koşullarda sağlama deneyleri gerçekleştirilmiştir. Ek olarak uzaklaştırma işleminden sonra meydana gelebilecek desorpsiyon konsantrasyonları ve tüm bu süreçte UOB maruziyeti kaynaklı olarak bitkide meydana gelebilecek değişimler incelenmiştir. RSM (Yanıt Yüzey Metodu) optimizasyonu sonuçlarına göre F. elastica ile toluen ve etanol bileşikleri için %90 üzerinde UOB uzaklaştırma verimine ulaşılabileceği görülmüştür. Elde edilen optimum şartlarda toluen için maksimum uzaklaştırma %92,01 etanol için ise %97,16 olarak bulunmuştur. Mikroçoğaltılmış yeni bitkilerle yapılan testlerde, UOB'ye maruz kalma sıklığıyla orantılı olarak, test sayısı arttıkça uzaklaştırma veriminde artış görülmüştür. Uzun süreli maruziyetin bitkide stres yanıtı olan antioksidan bileşiklerin artmasına, klorofil miktarında azalmaya ve stoma yapılarında doku hasarına sebep olduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak botanik filtrasyon sistemleriyle UOB'lerin yüksek verimlerde uzaklaştırabildiği, bu verimin yapılacak optimizasyon çalışmalarıyla daha da yüksek seviyeye ulaşabileceği görülmüştür. Botanik filtrasyon kapalı iç ortam havasındaki insan sağlığını tehdit eden bileşenler için ekonomik, verimli ve sürdürülebilir sistemlerin gelişiminde büyük bir öneme sahiptir.
Kombine klostridial aşı üretiminde kullanılmak üzere C. perfringes beta, epsilon ve C. novyi alfa toksinlerini üreten rekombinant suş geliştirilmesi
Enterotoksemi ve enfeksiyöz nekrotik hepatitis, küçükbaş hayvanlarda yüksek ölüm oranları ve ciddi ekonomik kayıplara yol açan, Clostridium türlerinin neden olduğu önemli bakteriyel hastalıklardır. Enterotoksemi, genellikle C. perfringens tip C ve D suşlarının toksinleriyle, enfeksiyöz nekrotik hepatit ise C. novyi tip B'nin toksinleriyle ilişkilidir. Bu hastalıkların kontrolünde geleneksel olarak aşılar ve hijyen/beslenme önlemleri kullanılmaktadır. Ancak klasik aşıların üretiminde yaşanan zorluklar, toksinlerin bağışıklık sistemini yeterince uyaramaması gibi sorunlar, daha etkili ve güvenli aşı stratejilerine olan ihtiyacı artırmıştır. Bu nedenle, rekombinant DNA teknolojisi ve sentetik biyoloji gibi modern yaklaşımlar, tanımlı antijenlerle yüksek verimli ve ölçeklenebilir aşı üretimine olanak sağlamaktadır. Bu tez kapsamında, enterotoksemi ve enfeksiyöz nekrotik hepatitise karşı etkin bir aşı adayının geliştirilmesinde kullanılmak üzere rekombinant E. coli suşlarının tasarımı ve inşası gerçekleştirilmiştir. Hedef toksin genlerini taşıyan "pCpDetx, j23119-pelB-CpDetx, pET-28 (a)-pelB-CpDetx, j23119-pelB-CpCcpb, pET-28 (a)-pelB-CpCcpb, j23119-pelB-CnBtcn-alpha, pET-28 (a)-pelB-CnBtcn-alpha" olmak üzere yedi farklı plazmid aracılı suş geliştirilmiştir. Bu plazmidler oluşturulurken ilave gen dizilerinin tasarıma eklenmesi ile daha yüksek seviyede protein ekspresyonu amaçlanmıştır. Ayrıca plazmidler, yüksek seviyede toksin üretimi sağlayabilecek konak sistemlerinde (ör. E. coli BL21 (DE3), C41 (DE3), C43 (DE3)) test edilmiştir ve E. coli C43 (DE3) suşu yüksek protein ekspresyonu gözlemlenmiştir. Ayrıca CpDetx ve CpCcpb toksin genlerin plazmid aracılı inşalarının yanı sıra, bu genler hem ayrı ayrı hem de ikili olarak genoma entegrasyonları da başarılı bir şekilde tamamlanmıştır. Bu doğrultuda "E. coli cpb+, E. coli etx+ ve E. coli etx+ cpb+ " olarak adlandırılan genoma entegre suşlar elde edilmiştir. Üretilen rekombinant toksin proteinlerinin ekspresyon düzeyleri SDS-PAGE ile analiz edilmiş, bant yoğunlukları karşılaştırılarak en uygun plazmid ve konak kombinasyonu belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, pET tabanlı ekspresyon plazmidini taşıyan (pET-28 (a)-pelB-CpDetx, pET-28 (a)-pelB-CpCcpb, pET-28 (a)-pelB-CnBtcn-alpha) E. coli C43 (DE3) suşu, toksin genleri için yüksek düzeyde protein ekspresyonu sağlamıştır.
Arkeik bir bakteri olan Haloarcula hispanica 2TK2 suşundan alfa amilaz üretimi
Enzimler biyolojik reaksiyonları katalizleyen, protein yapılı moleküllerdir. Son yıllarda biyoteknoloji alanındaki gelişmelerden dolayı; farklı kaynaklardan üretilen termostabil ve alkali stabil enzimlerin özellikle gıda ve deterjan sanayide kullanımı oldukça yaygınlaşmıştır. Enzimler bitkisel kaynaklardan, hayvansal kaynaklardan ve mikrobiyal kaynaklardan üretilebilmektedirler. Mikroorganizmalar kısa sürede hızlı üreyebildikleri için ve ürettikleri enzimlerin kontrolünün kolayca yapılabilmesinden dolayı; özellikle potansiyel enzim kaynakları olarak tercih edilmektedirler. Mikrobiyal kaynaklardan elde dilen enzimlerin aktivitelerinin yüksek olması, daha az yan ürün oluşturmaları, daha stabil ve ucuz olmaları nedeni ile; mikrobiyal kaynaklardan enzim üretimi konusu her geçen gün önem kazanmıştır. Halofilik arkealar ve haloarkeal proteinler çok yüksek tuz konsantrasyonlarına kolayca adapte olabilme özelliğine sahiptirler; bu nedenle haloarkeal proteinler ekstrem ortamlarda stabilitelerini ve fonksiyonlarını sürdürebilmektedirler. Halofillerde birçok haloarkel enzim tespit edilmiştir, bunlardan bir tanesi olan alfa amilaz enzimi endüstriyel anlamda oldukça önemli bir enzimdir.Bu çalışmada; Türkiye Tuzköy Tuz Madeni'nden izole edilen Haloarcula hispanica 2TK2 suşunundan elde edilen ?-amilaz enziminin özellikleri araştırılmıştır. 25 - 80 °C sıcaklık değer aralığında, 1 - 6 M tuz konsantrasyonu değer aralığında ve pH 4 - 10,8 değer aralığında; ?-amilaz aktivite tayin çalışmaları yapılmıştır. Maksimum enzim aktivitesinin elde edildiği; optimum pH, sıcaklık ve tuz konsantrasyon değerleri sırasıyla; 6,9, 52 °C ve 5 M olarak saptanmıştır. Ayrıca kültür ortamlarının tuz konsantrasyonları arttıkça, rölatif aktivite değerlerinin herbir numune için arttığı ve kültür ortamlarına eklenen nişastanın; halofilik bir arkea olan Haloarcula hispanica 2TK2 suşundan üretilen ?-amilazın aktivitesini önemli ölçüde arttırdığı saptanmıştır. Bunun yanısıra, elde dilen alfa amilaz enziminin; triton X 100, tween 80 ve propilen glikol gibi yüzey aktif maddelere karşı direnci araştırılmıştır. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar gösteriyor ki; Haloarcula hispanica 2TK2 suşunun ve elde edilen arkeal enzimin tuz toleransı oldukça yüksektir, enzim aktivitesi açısından oldukça geniş bir pH ve sıcaklık değer aralığına sahiptir ve çeşitli yüzey aktif kimyasallara karşı direnci oldukça yüksektir. % 50 (v/v) Triton X 100, % 50 (v/v) Tween 80 ve % 50 (v/v) propilen glikol varlığında dahi kalan enzim aktivitesi sırasıyla; % 49,87, % 47,62 ve % 66,47 olarak saptanmıştır. Yüksek tuz konsantrasyonları gibi ekstrem şartlar altında fonsiyonlarını ve stabilitelerini koruyabilen enzimlerin kullanımını gerektiren endüstriyel prosesler için potansiyel aday olarak dikkate alınabilir.Anahtar Kelimeler: ?-Amilaz, Haloarcula hispanica 2TK2, spektrofotometrik yöntem, rölatif aktivite, tuz toleransı
İlaç ve DNA taşıyıcı amfifilik blok kopolimerlerin RAFT yöntemi ile sentezi ve karakterizasyonu
Yapısal kararlılıkları, toksisitelerinin düşük olması, ilaç/gen taşıma kapasitelerinin yüksek olması, küçük boyutta olmaları ve suda çözünürlükleri sebebiyle blok kopolimerler polimer terapötikler içinde önemli bir sınıfı oluşturmaktadırlar. Blok kopolimerler; hidrofobik ve hidrofilik bloklardan oluştuğunda hidrofobik etkileşimlerle, iyonik ve noniyonik hidrofilik bloklar içerdiğinde elektrostatik etkileşimle veya uygun gruplar yapıya eklendiğinde kovalent bağlarla bir araya gelerek sulu çözelti içinde misel oluştururlar. İlaç veya DNA gibi moleküller blok kopolimer misel çekirdeğine yüklenerek bu moleküllerin hem fizyolojik engellerle etkileşimlerinde azalma hem de hedef dokuya ulaşım oranlarında önemli bir artış sağlanmaktadır. Tez çalışmasında, DNA veya ilaç taşıma ve salım potansiyeline sahip, amfifilik blok kopolimerlerin RAFT (tersinir katılmalı ayrışmalı zincir transfer; ?reversible addition-fragmentation chain transfer?) polimerizasyonu ile sentezi ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma ile 4-vinilpiridin (4-VP) ve oligoetilenglikol metil eter metakrilat (OEGMA) monomerleri kullanılarak, monodisperse yakın özellikte olan, DNA veya ilaç taşımaya uygun, ek modifikasyonlara izin verecek fonksiyonel gruplara sahip, amfifilik diblok kopolimerler elde edilmiştir. Polimerin yapısındaki fonksiyonel gruplar hedefleyici veya işaretleyici moleküllerin yapıya bağlanmasını olanaklı hale getirmektedir. Tez çalışması kapsamında öncelikle 4-VP ve OEGMA monomerleri için uygun RAFT ajanı ve reaksiyon şartları belirlenmiştir. Ardından, OEGMA RAFT yöntemiyle polimerleştirilmiş ve makroCTA haline getirilmiştir. MakroCTA zincirinin ucundan 4-VP monomeri polimerleştirilerek hidrofobik ilaç taşımada kullanılabilecek poli(OEGMA)-b-poli(4-VP) kopolimeri elde edilmiştir. Daha sonra, bu kopolimerdeki 4-VP birimleri kuarternerleştirilerek DNA taşımaya uygun pozitif yüklü blok kopolimerler elde edilmiştir. Sentezlenen polimerler GPC, FTIR spektroskopisi ve NMR spektroskopisi ile karakterize edilmiştir. Kopolimerlerin çözelti davranışları ve kuarterner kopolimerin c-myc genini inhibe eden oligonükleotidle oluşturduğu kompleksler ışık saçılması spektroskopisi, floresans spektroskopisi, atomik kuvvet mikroskobu ve UV spektroskopisi ile incelenmiştir. Poli(OEGMA)-b-poli(4-VP) blok kopolimerlerinin pH 5?in altındaki pH?larda çözeltide tek başlarına bulunduğu ancak pH 5?in üzerinde misel oluşturdukları saptanmıştır. Ayrıca belirli blok kopolimerlerin sıcaklığa duyarlı oldukları bulunmuştur. Kuarternerleştirilmiş pozitif yüklü kopolimerlerin de ODN ile kompleks oluşturduğu ve sıcaklığa bağlı olarak oluşan yapının değiştiği gözlenmiştir. Sonuçta, ilaç taşıyıcı olarak kullanılabilecek pH?a ve sıcaklığa duyarlı amfifilik blok kopolimerler ile gen terapi çalışmalarında kullanılabilecek sıcaklığa duyarlı pozitif yüklü blok kopolimerler elde edilmiştir.
Akut miyokard infarktüsünde iskemi modifiye albumin, oksidatif stres ve antioksidan enzim düzeylerinin araştırılması
İskemi, arterlerin kasılması veya tıkanması sonucu arterin beslediği bölgeye oksijen sağlanamaması durumudur. En yaygın görülen ve hayatı tehdit eden iskemiler kardiyak ve serebral iskemilerdir. Akut miyokardiyal iskemi (AMİ) halen tüm dünyada en sık görülen ölüm sebeplerinden biridir. Akut kardiyak iskemiye bağlı gelişen semptom ve bulguların hepsi akut koroner sendrom (AKS) olarak bilinmektedir. Miyokardiyal iskemide tanıda EKG bulgularıyla beraber, CK-MB, Troponin düzeylerinin belirlendiği biyokimyasal testler kullanılmaktadır. Ancak bu testler bazı vakalarda tanıda yetersiz kalmaktadır. Son yıllarda bu yöntemlere göre daha avantajlı olduğu düşünülen iskemi modifiye albumin (İMA) adlı yeni bir parametre üzerinde çalışılmaktadır. Yapılan araştırmalarda, İMA?nın iskemi doku oluşumundan itibaren artmaya başladığı ve 48 saat içinde normal seviyelere döndüğü bulunmuştur. İMA?nın en önemli oluşum nedeninin iskemik dokuda üretilen serbest radikallerin olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmada klinik, EKG ve biyokimyasal parametrelerle AMİ tanısı konulan hasta grubu ile kontrol grubu arasında, miyokardiyal iskemi ile bağlantılı olduğu düşünülen parametrelerin sistematik olarak incelenmesi yapılmıştır. Bu amaçla AMİ hasta grubu ve sağlıklı kontrol gruplarında, İMA seviyeleriyle beraber glutatyon peroksidaz (GPx), süperoksit dismutaz SOD ve katalaz KAT enzimlerinin aktivitesi araştırılmış, ve oksidatif stresin en önemli belirteçleri olan GSH ve MDA seviyeleri her iki grupta karşılaştırılmıştır. Sonuç olarak, AMİ tanısı konulan hastalarda İMA seviyeleri kontrol grubuna göre yüksek bulunmuştur. Hasta grubunda MDA seviyesinin yükseldiği, GSH seviyesinin ise düştüğü gözlenmiştir. Kardiyovasküler hastalıkların oluşumunda büyük etkisi olduğu düşünülen oksidatif stresin sonucu olarak hasta grubunda (SOD), (GPx) ve (KAT) enzimlerinin aktivitelerinin kontrol grubuna göre azaldığı bulunmuştur. Miyokard infarktüsü ile bağlantılı olan bu parametrelerin sistematik olarak incelenmesi yapılmıştır ve bu parametrelerin hastalığın erken teşhisinde, hastalıktan korunmada ve hastalığın gelişim mekanizmasının anlaşılmasına önemli katkılar yapacağı düşünülmektedir.
Bitkisel atıklardan karbonizasyon yoluyla farklı kullanım amaçlı katı materyallerin üretimi
Biyokütlenin karbonizasyon işlemiyle, havasız veya inert ortamda ısı etkisiyle bozundurulmasıyla, karbon içeriği yüksek katı, sıvı ve gaz ürünler elde edilmektedir. Biochar olarak adlandırılan karbonizasyon katı ürünü, biyoyakıt, metal indirgeyici, toprak iyileştirici ve aktif karbon gibi pek çok uygulama alanına sahip bir materyaldir. Toprak iyileştirici materyal olarak kullanımında, toprak asitliğini gidermesi, toprak katyon değiştirme kapasitesi ve su tutma kapasitesini iyileştirmesi, toprak için yararlı mikroorganizmlar için yaşam alanı oluşturması en önemli özelliklerindendir. Dünya nüfusundaki artış ile birlikte daha fazla sayıda yiyecek gereksiniminin oluşması, verimli tarım arazilerinin azalması, topraklı tarımın yanısıra topraksız tarım tekniklerinin de gelişmesini sağlamıştır. Biochar tarımda toprak iyileştiriciliğinin yanısıra topraksız tarımda da toprak yerine geçebilecek bir materyal olarak da kullanıma sahiptir. Hidrofonik sistem topraksız tarım yöntemlerinden birisi olup, besin solüsyonunda optimum bitki yetiştirme tekniğidir. Hidrofonik sistemlerde bitki kök ortamını destekleyici pek çok çeşitlilikte inert ve organik substratlar kullanılır. Biochar, sahip olduğu fiziksel ve kimyasal özellikleri ile hidrofonik sistemlerde, organik substrat sınıfında kök ortam destekleyici olarak çok yüksek bir kullanım potansiyeline sahiptir. Bu çalışmada, zeytin çekirdeği ve domates sapından split tipi boru reaktör kullanılarak farklı deney koşullarında biochar üretimi gerçekleştirilmiş ve sıcaklık, azot gazı debisi ve ısıtma hızının karbonizasyon katı ürün verimi üzerine etkisi incelenmiştir. En yüksek katı ürün (biochar) verimi değerleri 773 K karbonizasyon sıcaklığı, 5K/dak ısıtma hızı ve 500 ml/dak sürükleyici azot gazı debisi koşullarında sırasıyla zeytin çekirdeği için % 32.58 ve domates sapı için % 37.53 olarak elde edilmiştir. Karbonizasyon katı ürünlerinin karakterizasyon işlemleri, FTIR, TGA, SEM ve BET cihazları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Karbonizasyon katı ürünlerinin hem toprağa ilavesi şeklinde hem de direkt topraksız tarım katı ortam materyali olarak kullanımını araştırmak amacıyla domates fidesi yetiştirmede denenmiş, farklı oranlardaki karışımlarıyla perlit ve hindistan cevizi lifi gibi diğer topraksız tarımda kullanılan materyallerle karşılaştırması sunulmuştur. Tüm katı ortam materyalleri içinde, en uzun domates fidesi zeytin çekirdeği biocharı ortamında elde edilmiştir. Elde edilen tüm sonuçlar, zeytin çekirdeği biocharının topraksız tarım teknikleri için katı ortam materyali olarak kullanımını desteklemektedir.
HPMA ve poli(Q4-VP) bazlı çift katmanlı antimikrobiyal yara örtüsünün üretimi ve karakterizasyonu
Bu tez çalışmasında kendiliğinden iyileşmesi güç ve enfeksiyon riski yüksek olan yaraların iyileşmesini hızlandıracak ve yarayı bakteriyel istiladan koruyarak yara bölgesinde oluşabilecek ikincil travmaları önleyebilecek özellikte, toksik madde salım sorunu olmayan, poli(Q4-VP)-HPMA bazlı çift katmanlı yara örtülerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Yara örtüsünün antibakteriyel tabakasını oluşturan poli(Q4-VP) polimerinin sentezi iki aşamada gerçekleştirilmiştir. İlk aşamada 4-vinil piridin monomerinden serbest radikal polimerizasyonu ile poli(4-vinil piridin) polimeri sentezlenmiştir. İkinci aşamada ise üretilen poli(4-VP) polimeri 6-bromokaproik asit ile alkillenme reaksiyonuna sokularak antibakteriyel özellik göstermesi beklenen poli(Q4-VP) polimeri sentezlenmiştir. Sentezlenen polimerlerin yapısal analizi FT-IR ile gerçekleştirilmiştir. Yara örtü malzemesinin ilk katmanını oluşturacak olan makrogözenekli süngerimsi yapı HPMA'nın kriyojelasyonu ile hazırlanmıştır. Malzemenin ikinci katmanını oluşturan antibakteriyel poli(Q4-VP) membran ise elektroeğirme yöntemiyle kriyojel yapı üzerine yerleştirilmiştir. Oluşan çift katmanlı yara örtüleri SEM ile karakterize edilmiştir. Son olarak yara iyileşmesini arttırması amacıyla kriyojel tabakaya doğal iyileşme prosesinde etkili olan askorbik asit (C vitamini) yüklenmiş, C vitamini salımı UV spektrofotometre ile izlenmiştir. xiii Üretilen çift katmanlı yara örtülerinin antibakteriyel özellikleri S.aureus'a ve antifungal özellikleri C.albicans'a karşı incelenmiştir. Tez çalışması sonunda, çift katlı antibakteriyel özellikte, yüksek şişme kapasitesine sahip, yara iyileşmesini uyarıcı özellikte, geçici örtüler elde edilmiştir.
Alzheimer amiloid beta peptidine ait farklı amino asid dizilerinin polielektrolitler ile konjugasyon reaksiyonlarının incelenmesi
Amiloid terimi, özellikle son yıllarda bilim dünyasında önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Bunun en önemli sebebi, Alzheimer hastalığına neden olan en önemli etkenlerden birinin amiloid beta birikimlerinin meydana gelmesidir. Alzheimer hastalığı, yanlış katlanmış olan Amiloid Beta peptidlerinin beyinde plaklar şeklinde birikim oluşturması sonucu meydana gelmektedir. Bu plaklar genellikle 39-43 amino asitten oluşan ve amiloid beta (Aβ) denen küçük peptid dizilerinden oluşmaktadır. Aβ çok daha büyük bir protein olan ve amiloid öncül protein (APP) olarak bilinen daha büyük bir proteinin çeşitli enzimlerle parçalanması sonucu meydana gelir. Sonuç olarak oluşan Aβ peptid fragmentleri sinir hücrelerinin dışında birikerek senil plaklar denilen yapıları oluştururlar. Bu tez çalışmasında, çağımızın en önemli hastalıklarından biri olarak görülen Alzheimer hastalığına ait peptid bazlı aşı modeli, tanı kiti geliştirilmesi gibi alanlarda kullanılabilecek biyolojik aktiviteye sahip peptid- makromolekül biyokonjugatları ve fiziksel kompleksleri geliştirilmesi amaçlanmıştır. Amiloid beta (Aβ) peptidinin antijenik özellikteki 2 farklı amino asid dizisi ticari olarak satın alınmıştır. Her iki peptid dizisi ayrı ayrı 4 farklı taşıyıcı makromoleküle farklı mekanizmalar ve bağlanma dereceleri ile hem kovalent olarak bağlanmış, hem de bu taşıyıcılar ile fiziksel kompleksleri elde edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan taşıyıcı makromoleküller şunlardır: Poliakrilik asid (PAA), [Poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasid) veya VPAA], Dekstran aldehit (DA) ve Bovin Serum Albumin (BSA)'dir. Bu taşıyıcı moleküllerden PAA ve BSA ticari olarak alınmış olup, VPAA ve DA ise bölümümüzde sentezlenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Her iki peptid dizisinin de amino ucuna Triptofan amino asidi eklenerek bu peptidlere floresans özellik kazandırılmıştır. Böylelikle peptidlerin ve daha sonra sentezlenen biyokonjugatların florosans spektrofotometre cihazı ile incelenmesine olanak sağlanmıştır. Sentezlenen bütün biyokonjugat ve komplekslerin fizikokimyasal yapıları incelenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Biyokonjugat ve komplekslerin oluşumu, farklı spektroskopik ve kromatografik yöntemlerle aydınlatılmıştır. Elde edilen sonuçlar kıyaslandığında, sulu çözeltide karbodiimid varlığında kovalent bağlar ile oluşan biyokonjugatların daha verimli ve güçlü bağlandığı görülmüştür. Konjugasyon reaksiyonunun oluşumu sırasında floresans boya kullanılarak Floresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) yöntemi yardımı ile; intermoleküler mesafe hesabı yapılıp, biyokonjugattaki donör ve akseptör arasındaki mesafe hesabı ile elde edilen bilgiler, saf peptidin konformasyonu ve biyokonjugat oluşumu durumunda peptidin konformasyonundaki değişimler hesaplanmış ve sayısal değerlerle de ifade edilmiştir. Ayrıca literatürde ilk kez Trp içeren Amiloid beta (1-21) peptid dizisi modellenmiş, moleküler mekanik yöntem ile minimum enerjiye sahip olduğu optimize geometrisi belirlenmiştir. FRET yöntemi ile deneysel verilere dayalı elde edilen sayısal değerlerin, teorik olarak hesaplanan değerler ile örtüştüğü ispatlanmıştır. Sentetik aşı modeli olarak tasarladığımız Amiloid beta (Aβ) peptidinin-taşıyıcı makromolekül biyokonjugatları için; in vivo uygulamalarda kullanılan düşük konsantrasyonlarda MCF-7 hücreleri üzerinde yapılan çalışmalarda elde edilen biyokonjugatların özellikle düşük dozlarında önemli derecede toksik bir etki göstermediği ortaya konulmuştur. Ayrıca bu biyokonjugatlarla yapılan MTT deneyleri ile hücre canlılık oranları da kontrol edilerek, IC50 değerleri hesaplanmıştır. Tez kapsamında hücre kültürü ile ilgili yapılan bir diğer çalışmada ise, her iki peptid dizisine ait farklı konsantrasyonlarında sentezlenmiş olan fiziksel kompleksler ve biyokonjugatlar, tek başına taşıyıcı makromoleküller ve tek başına peptid dizileri, işaretleme gerektirmeden, 72 saat boyunca gerçek zamanlı (real-time) ölçüm alan yeni bir yöntem olan XCELLienge Sistemi ile İnsan Umbilikal Ven Edotel Hücreleri (HUVEC) hücrelerine uygulanmış ve bu maddelerin hücrelerin çoğalma hızına etkileri ve toksik etkileri incelenmiştir. Biyokonjugat ve fiziksel kompleksin HUVEC üzerindeki etkileri kıyaslandığında ise, özellikle kovalent bağla bağlanmış olan biyokonjugatların hücre çoğalması üzerinde önemli bir negatif etkisinin olmadığı görülmüş ve hem MCF-7 ile hemde HUVEC ile yapılan hücre çalışmaları sonucunda elde edilen veriler ile de biyokonjugatların deney hayvanları üzerinde kullanabilirliği ortaya konulmuştur. Böylece bu tez kapsamında sentezlenen konugatların Aβ'nın Alzheimer hastalığına karşı spesifik antikorlarının elde edilmesi, nanobiyosensörlerinin oluşturulması, tanı kitlerinin ve biyoteknolojik aşılarının geliştirilmesine ışık tutacak bir çalışmadır. Anahtar Kelimeler: Amiloid beta peptidi, Alzheimer, biyoteknolojik aşılar, biyokonjugat, kovalent konjugasyon, adjuvant, karbodiimid, toksisite.
PEM yakıt pilleri için anot ve katot malzemelerinin geliştirilmesi
Gelişen teknoloji, artan nüfus ve refah düzeyi enerji tüketimini arttırmıştır. Bu ihtiyaçtan doğan teknolojilerden biri de PEM yakıt pili teknolojisidir. Bu teknolojinin diğer enerji dönüşüm sistemlerine göre daha verimli ve sürdürülebilir olması bir avantaj oluşturmasına rağmen katot ve anotta kullanılan değerli metal olan platin miktarının yüksek olması yaygınlaşması önündeki en büyük engellerden biri olarak ortaya çıkmaktadır. Platinin miktarını azaltmak üzere çeşitli karbon destek malzemeleri kullanılmıştır. Bu çalışmada tek ve çift değerlikli iyonların ölçümüne karşı iyi sonuç veren modifiye grafitin karbon destek malzemesi olarak kullanımı araştırılmıştır. Platin öncülleri karbon destek malzemesi üzerine farklı tekniklerle indirgenerek tutturulmuştur. Hazırlanan Pt/C malzemesinin elektrokimyasal analizleri yapılarak performans özellikleri araştırılmıştır. Ayrıca yüzey özelliklerini araştırmak üzere SEM, BET ve BJH analizi yapılmıştır.
Çinko proteinlerinin biyosensör uygulamaları için in siliko optimizasyonları
Günümüzde proteinlere yeni bir fonksiyon kazandırmak ve geliştirmek için birçok çalışma yapılmaktadır. Proteinler, metal iyonlarına geniş bağlanma afinitesi aralığında bağlanarak çeşitli fonksiyonlar gösteren potansiyel sensör moleküllerdir. Proteinlerin metallere bağlanma afinitelerini optimize etmek için çeşitli teknikler mevcuttur. Geleneksel yöntemlerden biri olan "site directed mutagenesis" ile metallerin bağlanma afinitelerini istenilen seviyede optimize etmek zaman alıcı ve zordur. Bu yöntemin bir başka dezavantajı da ekspresyon sırasında inklüzyon cisimcikleri oluşabilmesidir. Ayrıca saflaştırma sırasında eklenen tag dizileri FRET sisteminde spesifik olmayan etkileşimlere yol açabilir. Bu bilgiler ışığında sensör molekülün kararlı ve küçük olması sonucuna varabiliriz. Bu doğrultuda hesapsal bir yaklaşımla daha hızlı sonuçlara ulaşacağımızı öngörmekteyiz. Bu öngörüyle bilgisayar ortamında üç boyutlu yapısı bilinen çinko bağlı kısa peptidlerin optimizasyonunu amaçlamaktayız. Yaptığımız çalışmalarda FoldX programıyla çinko civarı 70 aminoasitten kısa peptidlerdeki aminoasitleri değiştirip mutasyondan önceki ve sonraki afiniteleri elde edebilmekteyiz. Autodock programını da FoldX programını doğrulmak amacıyla birkaç proteinde redocking yöntemiyle kullandık. Çalışmamızın sonucuda hem daha stabil hem çinkonun bağlanma afinitesi artmış mutantlar saptadık. Bu mutantlardan en uygununu seçip deneysel olarak doğrulanması amaçlanmaktadır.
Kimyasal buhar çöktürme yöntemi ile biyosilika tabanlıkta karbon nanotüp üretimi ve kompozitlerinin doku mühendisliğinde incelenmesi
Karbon nanotüpler (KNT) nanoteknolojide öne çıkan en önemli malzemelerden biridir. Üstün mekanik ve yüzey özellikleri karbon nanotüplerin doku mühendisliğinde kullanımını mümkün kılmaktadır. Kemik doku mühendisliğinde doku iskelesi yapımında güçlendirici ve ek malzeme olarak kullanın yanı sıra KNT'lerin hücre büyümesini ve farklılaşmayı arttırıcı etkileri de görülmüştür. Bu yüksek lisans tezi kapsamında karbon nanotüplerin kimyasal buhar çöktürme yöntemiyle üretimi ve doku mühendisliğinde kullanımı araştırılmıştır. Deneysel olarak kimyasal buhar çöktürme yöntemi ile 700°C'de Fe(NO3)3.9H2O katalizörü ve metan gazı ile karbon nanotüp üretilmiştir. Katalizör işlevi gören demir(III)nitrat ile pirinç kabuğu külünden elde edilen biyo kaynaklı sodyum silikat çözeltisi kullanılarak iki tip üretim yapılmıştır. Ayrıca Silika başlatıcısı olarak TEOS'ta kullanılarak karbon nanotüp üretilmiştir. Üretilen karbon nanotüplerin SEM ve TEM cihazı ile karakterizasyonu yapılmıştır. Katalizörün sodyum silikat çözeltisiyle kullanıldığı yöntem ile üretilen karbon nanotüplerin poli laktik asit (PLA) ile doku iskelesi olarak kompozit filmleri hazırlanmış ve mekanik dayanım testlerinden çekme gerilme dayanım testi yapılmıştır. Üretilen KNT-PLA filmlerin mekanik dayanımları dört kat artmıştır. Ayrıca karbon allotroplarından grafen ile karşılaştırma yapılmıştır. Grafen ile KNT'ler ile oluşturulan kompozit filmlerin mekanik dayanıklılıklarının yaklaşık olarak aynı olduğu tespit edilmiştir. Üretilen KNT ve grafen filmler doku iskelesi olarak kullanımı için kemik kanser hücreleri seçilmiştir. Hücre kültürü yapılarak hücre çoğalması üzerine etkileri incelenmiştir. PLA doku iskelesinde hücreler sadece çoğalırken KNT kompozit doku iskelelerindeki hücrelerin aynı anda hem çoğaldığı hemde farklılaştığı görülmüştür. Grafen ile kıyaslandığında KNT içeren doku iskeleleri ile daha fazla kemik hücresi elde edilebilmektedir.
İnsan olfaktör kök hücrelerin izolasyonu kültürünün yapılması karakterizasyonu ve hasar görmüş fasiyal sinirin (ratlarda) rejenerasyonuna etkisinin incelenmesi
Fasiyal paraliz dünyada ve ülkemizde görülen, popülasyonda 30/100.000 insidansı olan, konjenital, nörolojik, metabolik, toksik, neoplastik, enfeksiyöz, travmatik, iatrojenik ve idiopatik nedenlere bağlı olarak ortaya çıkabilen bir hastalıktır. Bu hastalık, insan sağlığını ciddi olarak etkilemenin yanında estetik ve dolayısıyla psikolojik problemlere de neden olur. Şimdiye kadar hastalığın tedavisine yönelik çeşitli yaklaşımlar uygulanmasına rağmen gerek iyileşme hızı gerekse de iyileşme hızına bağlı sekeller, hastalığın tedavisinin önünde önemli engeller oluşturmaktadır. Bu nedenle hasar görmüş sinire bağlı patolojilerin giderilmesinde yeni yaklaşımların geliştirilmesi oldukça önemlidir. Kök hücre alanındaki gelişmeler ve kök hücreye dayalı tedavi yaklaşımlarındaki ilerlemeler sinir doku hasarlarının tedavisinde de yeni ümitlere yol açmaktadır. Periferik sinir hasarlarında yağ, kemik iliği ve hipokampal nöral kök hücre kullanan deneysel çalışmalarda bazı olumlu sonuçlar elde edilse de problemin çözümü henüz mümkün olmamıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda kök hücre tedavilerinde başarının sağlanması için hasar görmüş bölgenin sahip olduğu mikroçevre ile uygulanan kök hücre kaynağının uygun olması gerektiği vurgulanmaktadır. Literatürde bu konu ile ilgili çalışmalar az sayıda olsa da giderek önem kazanmaktadır. Ayrıca şimdiye kadar fasiyal sinir hasarlarının rejenerasyonunda bu alanda herhangi bir çalışmaya da rastlanılmamıştır. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı; insan olfaktör mukoza biyopsi öneklerinden kök hücrelerin izolasyonu, devamlı kültürünün yapılması, karakterizasyonu ve kriyoprezervasyonunu gerçekleştirilmekle, olfaktör kök hücrelerden yeterli miktarda hücre kitlesi elde edilip ilk kez olarak hasar görmüş fasiyal sinir rejenerasyonunda (ratlarda) niş temellerine dayalı yeni bir yaklaşım geliştirilmesi ayrıca ileride hücresel tedaviler ve doku mühendisliği çalışmalarında kullanılmak üzere olfaktör kök hücre kriyobankının oluşturulması olmuştur. Bu amaçla tez kapsamında İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kulak Burun Boğaz Baş ve Boyun Cerrahisi Bölümü'nde septoplasti operasyonu öncesi onamları alınan 3 hastadan olfaktör mukoza biyopsi örnekleri alınarak Yıldız Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Hücre Kültürü ve Doku Mühendisliği Laboratuvarı'nda getirildi ve olfaktör kök hücrelerin izolasyonu, kültürü, karekterizasyonu ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi. Devamlı kültürü yapılan hücreler morfolojik olarak incelendi. Elde edilen hücrelerin kök hücre karakterizasyonunu yapmak üzere hücreler adipojenik, osteojenik ve nörojenik farklılaşma kitleri ile indüklendi ve akım sitometri yöntemi ile immünfenotipik karakterizasyonları yapıldı ve elde edilen kök hücrelerin kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi. Olfaktör kök hücreler, in vivo çalışmalarda kullanılmak üzere CM-DiI ile işaretlendi ve hücrelerin üst üste 9 kez pasajlanmasıyla çok tabakalı hücre kitlesi elde edildi. Elde edilen çok tabakalı hücre kitlesinin canlılığının belirlenmesi için in vitro kültürü yapıldı. CM-DiI ile işaretli olfaktör kök hücre kitlesi ile deneysel fasiyal paraliz oluşturulan ratlarda kök hücrelerin periferik sinir rejenerasyonuna etkisini belirlemek üzere in vivo çalışmalar iki aşamada gerçekleştirildi. Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarı'nda 7 adet Wistar Hannover (350–380 gr) dişi rat kullanılarak yapılan ön çalışmalarda fasiyal kesi sonrası 4 farklı yöntem kullanılarak kök hücrelerin kesi bölgesine inokülasyonu sağlandı. Çalışmada 1. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi, 2. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi ve inokülasyon bölgesi rattan alınan yaklaşık 1mm3 yağ dokusu ile (fasya) ile sarıldı, 3 ve 4. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi ve inokülasyon bölgesine fibrin glue uygulaması yapıldı, 5 ve 6. ratların hasar bölgesine CM-DiI ile işaretlenen çok tabakalı hücre kitlesi inoküle edildi, kontrol grubu olarak 7. ratın hasar bölgesine 10µl PBS aktarıldı. Deney öncesi fasiyal paralizin ölçümü, deney sonrası ise iyileşmenin belirlenmesi için tam kat kesi öncesi ve sonrası 2., 4., 6., ve 8., haftalarda bıyık hareketleri Wiskers skorlama olarak değerlendirildi. Sonuçlar Mann Whitney U istatistiği kullanılarak hesaplandı. Ön çalışma sonuçları dikkate alınarak in vivo çalışmaların ikinci basamağında 27 adet rat M, T ve K isimleri verilerek 3 gruba ayrıldı her bir grupta ratların sol fasiyal siniri kesildikten ve sinir uçları neurotube poliglikolik asit konduite anastomoz yapıldı. Konduitin içine M grubu için hazırlanan çok tabakalı hücre pelleti, T grubu için PBS eklendi. Kontrol grubu olan K grubuna herhangi bir madde verilmedi. Ratlarda iyileşme 2., 4., 6., 8., ve 10. haftalarda fizyolojik, bıyık hareketleri ve elektrofizyolojik olarak izlendi. 10 hafta sonunda ratlar sakrifiye edilerek hasar bölgesinden histolojik inceleme için preparatlar hazırlandı. Preparatlar hematoksilen, eozin, S100, Toluidin Blue ile boyandı ve florasan mikrokopta incelendi. Sonuçlar Mann-Whitney U ile ve Annova ile yapılan istatistik ile değerlendirildi. Elde edilen sonuçlara göre olfaktör dokudan elde edilen hücrelerin morfolojik, immünfenotipik ve farklılaşma özellikleri bakımından kök hücre karakterine sahip oldukları ayrıca dondurularak saklanan hücrelerin 24 ay sonunda canlılıklarını %91 oranında korudukları belirlendi. Olfaktör kök hücrelerin CM-DiI boyası ile işaretlediği ayrıca hücrelerin 9 kez üst üste pasajlanmasıyla elde edilen çok tabakalı hücre kitlesinin kültür ortamında canlılığını koruduğu belirlendi. Whiskers skorlamalarına göre yapılan ön çalışma sonuçlarına göre, uygulanan 4 farklı yöntem içinde en fazla iyileşmenin görüldüğü grubun olfaktör kök hücreler ile hazırlanan çok tabakalı hücre kitlesi uygulanan grup olduğu belirlendi. 27 rat ile yapılan in vivo çalışmalarda elde edilen fizyolojik ve elektrofizyolojik sonuçlara göre fasiyal sinir rekonstrüksiyonunda olfaktör kök hücreler kullanılan grupta sinir rejenerasyonun daha hızlı gerçekleştiği (p=0,030) ve bıyık hareketlerindeki düzelmenin amplitüd değerlerindeki artış ilişkili olarak daha fazla ve anlamlı olduğu belirlendi (p=0,001). S100 boyama ile yapılan histolojik değerlendirmede gözlenen sonuçlara bakıldığında da M grubunda hasar bölgesine nakledilen kök hücrelerin Schwann benzeri hücrelere dönüştükleri belirlendi. Elde edilen bu sonuçlar olfaktör kök hücrelerin kullanıldığı grupta belirlenen sinir rejenerasyon hızı ve düzeyini destekler niteliktedir (p<0,05). 2012-07-04 KAP02 numaralı proje ile Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Proje Koordinatörlüğü tarafından desteklen bu çalışma ile TÜBİTAK tarafından yayınlanan 2003-2023 Teknoloji Öngörü Çalışmasında vurgulanan "Türkiye'de yapılması gereken bilimsel çalışmalar için kök hücre teknolojilerinin geliştirilmesi ve özellikle rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılabilir hale gelmesi" hedefine de uygun olarak ulaşılabilir tek nöral kök hücre olan olfaktör kök hücrelerin ülkemizde ilk kez olarak izolasyonu, karakterizasyonu ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi, kriyobankı oluşturuldu, doku mühendisliğinde kullanılmak üzere çok tabakalı hücre kitlesi hazırlandı ve fasiyal sinir hasarlarında kullanılmasıyla sinir rejenerasyonunu hızlandıran etkin bir hücresel tedavi yöntemi önerildi.
İnsan adipoz dokusu ve adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere kriyoprezervasyonunun optimizasyonu
Amerikan Plastik Cerrahi Derneği verilerine göre, Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD) 2012 yılı içerisinde yaklaşık 300.000 civarında yumuşak doku defekti tamiri amacı ile mastektomi sonrası meme, el ve yüz gençleştirme işlemlerini de kapsayan cerrahi işlem gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın her yıl giderek arttığı bilinmektedir. Ülkemizde ise bu alanda çalışmalar yapılsa da rakamsal bir bilgi bulunmamaktadır. Son yıllarda yumuşak doku mühendisliği ve klinik doku tamiri uygulamalarında kök/progenitör hücrelerin kullanılması ve bu yolla elde edilmiş yapay dokuların oluşturulması gibi yeni yaklaşımlar ve çalışmalar, yer almaktadır. Bu bağlamda lipoaspirasyon metodu ile elde edilebilen otolog adipoz doku, içerdiği zengin kök/progenitör hücre popülasyonu sayesinde adı geçen yumuşak doku defektlerinin giderilmesinde ve iyileştirilmesinde yüksek potansiyele sahiptir. Dünya genelinde yılda milyonlarca lipoaspirasyon ve kozmetik amaçlı adipoz doku rezeksiyonu uygulaması yapılmaktadır. Bu uygulamalardan elde edilen adipoz dokuların etkin ve verimli olarak yakın gelecekte yumuşak doku travmaları dışında pek çok farklı doku mühendisliği veya rekonstrüktif cerrahi uygulaması için doğal otolog doku kaynağı olabileceği düşünülmektedir. Elde edilen adipoz dokunun veya içerdiği progenitör hücrelerin daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezervasiyonunun yapılması, kriyopbankta uzun sure saklanması ve gerektiğinde biyolojik özelliklerini kaybetmeden kriyobanktan çıkarılarak çözülmesi, ve alıcının ihtiyaç duyulan bölgesine nakli sonrasında iyi sonuçların elde edilmesi oldukça önemli olup, yumuşak doku mühendisliği ve plastik/rekonstrüktif cerrahinin esas hedeflerinden biridir. Ancak kriyobiyolojinin bu alanında hücre ve dokuların dondurulma/çözülmeleri sonrası klinik kullanımlarıyla ilgili varolan ciddi problemler (insan adipoz dokusu ve aynı dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin, çözme sonrası düşük viabilite, nakledilen bölgede yüksek re-absorbsiyon vb.) halen giderilememiştir. Şimdiye kadar dünyada bu alanda çeşitli çalışmalar yapılsa da halen verimli bir adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyon yöntemi geliştirilememiştir. Bunun nedenlerinden biri, şimdiye kadar uygun kriyoprotektanların, kriyoprotektan konsantrasyonlarının, karışımlarının, vitrifikasiyon gibi önemli kriyoprezervasiyon yönteminin adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücrelerde yeterince incelenmemiş olmasıdır. Ayrıca mevcut yaklaşımların doku yenileme ve uygulanan bölgede mevcut hasarın tamirindeki etkinliği konusunda bugüne kadar gerçekleştirilen az sayıda klinik-öncesi ve klinik çalışmada, kök hücre ve içinde bulunduğu niş özellikleri dikkate alınmadığından çalışmalar her zaman olumlu sonuçlar vermemektedir. Mevcut bilgilere dayanarak bu tez çalışmasının amacı, yumuşak doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere insan adipoz dokusu ve aynı dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin, mevcut konvansiyonel yöntemler ile kriyoprezervasyonundaki yapısal ve fonksiyonel düzeydeki etkinliklerinin belirlenmesi, adipoz doku ve içerdiği kök hücrelerin kriyoprezervasyonu ile ilgili mevcut problemlerin giderilmesinde vitrifikasyon metodu ile kriyoprezervasyon rejimlerinin ve yaklaşımlarının etkinliğinin incelenmesi, elde edilen verilere dayanarak insan adipoz doku/adipoz doku-kaynaklı mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyon protokollerinin optimize edilmesi ile klinik kullanıma uygun doku ve hücre saklama amaçlı kriyobank oluşturulmasıdır. Belirlenen amaç doğrultusunda çalışma genelinde 10 farklı donörden lipoaspirasyon (n=8) ve cerrahi eksizyon (n=2) uygulamaları sonrası elde edilen adipoz doku örnekleri kullanıldı. Örneklerin 6'sına adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücre izolasyonu amacı ile enzimatik ayrıştırma tekniği uygulandı. Hücre izolasyonu aşamasında ayrıca manyetik tabanlı hücre ayrıştırılması tekniği de kullanıldı. İzole edilen hücrelerin kök hücre olma özellikleri in vitro kültürdeki morfolojik analiz, akış sitometrisi (CD90, CD105, CD29, CD34, CD45) ve in vitro ekspansiyon/farklılaşma testleri kullanılarak ölçüldü. Doku ve hücre kriyoprezervasyonu için, içerisinde kriyoprotektan olarak DMSO, etilen glikol ve sükroz'un farklı konsantrasyonları veya kokteylleri bulunan aşamalı yavaş dondurma (%10 DMSO; %10DMSO+0,2M sükroz; 0,5M sükroz) ve vitrifikasyon teknikleri (%15 DMSO+%15 etilen glikol+0,5M sükroz; %30DMSO+%30 etilen glikol+0,5M sükroz) kullanıldı. Kriyoprezervasyon sonrası dokuların yapısal durumları immünohistokimya tekniği ile, hücrelerin yapısal ve fonksiyonel durumları ise Tripan mavisi boya dışlama testi, TUNEL testi ile DNA fragmantasyon analizi ve in vitro farklılaşma analizi kullanılarak ölçüldü. Çözme sonrası doğrudan dondurulan veya dondurulmuş dokudan izole edilen hücreler ayrıca morfolojik ve in vitro ekspansiyon özellikleri bakımından incelendi. İncelemeler ve ölçümler sırasında elde edilen kantitatif veriler SPSS versiyon 10.0 for windows programı ile değerlendirildi ve değerlendirme sırasında p<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Deney üç aşamada gerçekleştirildi. İlk aşamada elde edilen örneklerden 6'sında (4 örnek lipoaspirasyon ve 2 örnek cerrahi eksizyon yöntemi) enzimatik ayrıştırma metodu uygulanarak hücre izolasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen bu hücrelerin in vitro kültürdeki gelişim ve morfolojik özellikleri, akış sitometrisinde elde edilen kök hücre işaretçikleri sonuçları ve in vitro farklılaşma sonrası mezoderm kaynaklı farklı hücrelere dönüşüm özellikleri gösterildi ve mezenkimal kök hücre oldukları konfirme edildi. İkinci aşamada bu hücreler kullanılarak mevcut konvansiyonel kriyoprezervasyon ve vitrifikasyon protokollerinde kullanılan DMSO ve etilen glikol (EG) kriyoprotektanlarının farklı konsantrasyonları (%1 - %30), farklı kombinasyonları ve hücre ile farklı inkübasyon süreleri (10 – 40 dakika) bakımından sitotoksik ve genotoksik etkileri incelendi. DMSO ve etilen glikolün %10'dan yüksek konsantrasyonlarında ve 20 dakika'dan uzun inkübasyon sürelerinde hücresel canlılık düzeylerinde anlamlı azalma gözlendi (p<0,05). Hücre viabilite incelemesi ile eş zamanlı gerçekleştirilen DNA fragmantasyon testlerinde ise adı geçen parametreler yönünden istatistiksel olarak anlamlı bir artış görülmedi (p>0,05). Çalışmanın üçüncü aşamasında, deney kapsamında elde edilen insan adipoz dokuları (n=4) ve adipoz doku-kaynaklı mezenkimal kök hücreleri (n=4), mevcut konvansiyonel ve vitrifikasyon protokolleri kullanılarak doku ve hücre dondurma programlarına alındı. Her iki grup, ayrı ayrı olarak iki farklı metod (aşamalı yavaş dondurma ve vitrifikasyon), farklı inkübasyon süreleri ve kriyoprezervasyon sonrası farklı saklama sıcaklıkları yönünden test edildi. Hücre düzeyinde gerçekleştirilen kriyoprezervasyon uygulamalarında, aşamalı yavaş dondurma gerçekleştirilen %10 DMSO ve %10DMSO+0,2M sükroz grubu ile, vitrifikasyon uygulanan VS1 ve VS2 gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek canlılık oranları elde edildi (sırasıyla %80,2, %88,9, %85,4, %68,2 ve %12,2; p<0,01). Doku düzeyinde gerçekleştirilen kriyoprezervasyon uygulamalarında ise vitrifikasyon uygulanan VS1 ve VS2 grubunda, aşamalı yavaş dondurma uygulanan %10 DMSO ve %10 DMSO+0,2M sükroz gruplarındaki dokulara ve kontrol grubuna kıyasla daha yüksek canlılık oranları elde edildi (sırasıyla %90,2, %82,0, %50,0, %62,8 ve %10,2; p<0,01). Aşamalı yavaş dondurma grubunda dondurulan doku örneklerinin ve içerdikleri kök hücrelerin +4°C 'de ve -20°C'de uzun süreli saklanmaları sonrası canlılık ve fonksiyonelliklerini kaybettikleri gözlendi. Gerek hücre, gerekse doku düzeyinde gerçekleştirilen dondurma ve çözme işlemleri sonrası canlı olarak tespit edilerek kültüre edilen hücrelerin, yapılan in vitro ekspansiyon ve in vitro farklılaşma testlerinde, hücre gelişim hızlarında ve adipojenik, kondrojenik ve osteojenik farklılaşma potansiyelleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gözlenmedi. Sonuç olarak bu tez çalışması kapsamında, günümüzde kullanılmakta olan farklı konvansiyonel doku ve hücre kriyoprezervasyon protokollerinin ve mevcut literatürde ilk kez olarak farklı vitrfikasyon protokollerinin adipoz doku ve içerdiği mezenkimal kök hücreler üzerindeki etkinlikleri eş zamanlı olarak incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar, aşamalı yavaş dondurma ve vitrifikasyon yöntemi kapsamında kullanılan kriyoprotektanların ve uzatılmış inkübasyon sürelerinin insan adipoz dokusu ve içerdiği mezenkimal kök hücrelerinin viabilitesi ve fonksiyonelliği üzerinde ciddi ve olumsuz etkiler oluşturabildiğini göstermiştir. Sonuçlar ayrıca kriyoprezervasyon işlemlerinin klinik etkinliğinin arttırılması amacı ile doku ve hücre dondurma işlemlerinin ayrı ayrı optimize edilmesi ve uygulanması gerektiğini de doğrulamıştır. Bu bulgulara ilave olarak, mevcut güncel çalışmalarda raporlanmış konvansiyonel saklama sıcaklıklarının (+4°, - 20°C ) adipoz doku ve içerdikleri ADK-MKH popülasyonunun uzun vadeli etkin ve verimli saklanması için yeterli olmadığı görülmüştür. Sonuç olarak tez kapsamında bir adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyonunda en uygun dondurma rejiminin doku için vitrifikasyon, ADK-MKH'ler için ise aşamalı yavaş dondurma olduğu saptanmıştır. Bu bilgiye dayanarak adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücrelerin kriyoprezervasiyon protokolları geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Çalışmamız sırasında elde edilen sonuçlar doğrultusunda ayrıca etkin bir doku ve hücre kriyobankı oluşturulmuştur. Sonuçlarımızın, yakın gelecekte kök hücre ve doku mühendisliği alanında gerçekleştirilecek yeni araştırma, klinik öncesi veya klinik kullanım amaçlı üretim teknikleri, hücre karakterizasyonu ve farklılaştırma çalışmalarında kullanılmak üzere önemli bir kaynak oluşturacağı düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Adipoz doku, ADK-MKH, Yumuşak doku mühendisliği, Kriyoprezervasyon, Aşamalı yavaş dondurma, Vitrifikasyon.
Amilaz ve asit fosfataz tespit kitinin geliştirilmesi
Amilaz tükürükte bol miktarda bulunan ve tükürük biyomarkerı olarak kullanılan bir enzimdir. Asit fosfataz ise semende yoğun olarak bulunmakta ve semen varlığının tespitinde kullanılmaktadır. Tükürük ve semenin tespiti özellikle adli tıpta cinsel saldırı vakalarında kanıt niteliği taşımaktadır. Tez çalışmasında cinsel saldırı vakalarında biyolojik kanıt olan semen (asit fosfataz) ve tükürüğün (amilaz) tespiti için yeni bir yöntemle tanı kiti geliştirilmiştir. Asit fosfataz tespiti için kullanılan yöntem alfa naftil fosfatın enzim varlığında naftole hidrolize olması ve ortaya çıkan bu ürünün diazonyum tuzu ile birleşerek renk değiştirmesi prensibine dayanmaktadır. Amilaz tespiti için ise nişasta iyot testi kullanılmıştır. Her iki test için hazırlanan reaksiyon çözeltileri özel bir jel matrikse emdirilerek destek ortam oluşturulmuştur. Semen örneklerinde hassasiyet tespiti için 10.000 ila 100.000 arasında, amilaz tespiti için ise 100 ila 1000 arasında seyreltmeler uygulanmıştır. Zamana bağlı aktivite tayini için 5 mm2 çaplı pamuklu kumaşlara semen ve tükürük örneklerinden 10 µl damlatılarak kurumaya bırakılmıştır. 0., 1., 6., 12., 24., 36., 48., 60., 72. saatlerde distile suyla çözülerek analizi yapılmıştır. Semen örneklerinde asit fosfataz tespitinde 1/70.000, tükürük örneklerinde amilaz tespitinde ise 1/900 seyreltme oranlarına varan başarı elde edilmiştir. Zamana bağlı aktivite tayininde literatür de aktivitenin büyük bir çoğunluğunun kaybedildiği bildirilen 72. saatte bile enzim aktivitesi tespit edilmiştir. Çalışmada geliştirilen matriks destekli yöntemin oldukça pratik ve hassas olduğu saptanmıştır.