Theses supervised by Prof. Dr. Emin Türkay Korgun
13 theses · Akdeniz University
Hiperglisemik koşullarda ve diyabetik plasentalarda mTOR sinyal yolağının anjiyogenez mekanizmasına etkisi
Plasenta kompleks bir vasküler sisteme sahiptir ve feto-plasental damar sistemi maternal ve fetal düzenlenişlerdeki hatalara oldukça duyarlıdır. Vasküler yapıların gelişimi ve fonksiyonu diyabetik çevreden etkilenmektedir. Anjiyogenez süresinde pek çok kritik basamak, çeşitli moleküller ve sinyal iletim yolakları tarafından düzenlenmektedir. mTOR sinyal iletim yolağının anjiyogenez mekanizmalarında rol oynadığı bilinmektedir. Ancak diyabetik gebeliklerde mTOR yolağının plasental anjiyogenez mekanizmaları üzerindeki etkileri bilinmemektedir. Bu nedenle bu çalışmada, kültür ortamında HUVEC hücrelerine yüksek miktarda glikoz verilerek, hipergliseminin anjiyogenez mekanizmaları üzerine etkisi ve bu etkinin mTOR sinyal iletim yolağına bağlı olup olmadığı değerlendirilmiştir. Elde ettiğimiz verilere göre, hiperglisemik koşullarda VEGF ekspresyonu mRNA düzeyinde, çözünür VEGF ekspresyonu ise protein düzeyinde artmıştır. VEGFR2 hem mRNA hem de protein düzeyinde artış gösterirken VEGFR1 sadece mRNA düzeyinde artmıştır. mTOR'un hedef proteinlerinden biri olan 4EBP1'in fosforilasyonu hiperglisemik koşullarda artmıştır. Akt fosforilasyonu azalmış, p70S6K fosforilasyonu ise değişmemiştir. HIF-1α ekspresyonu ise mRNA düzeyinde artmıştır. Rapamisin ve PP242 inhibisyonu ile hiperglisemik koşullarda artan 4EBP1 ve VEGFR2 ekspresyonu azalmıştır. Matrijel ve yara iyileşme analizi sonuçlarına göre hiperglisemik koşullarda endotel hücre migrasyonunun ve damar tüpü oluşturma kapasitesinin arttığı, mTOR yolağı inhibisyonu ile bu artışın baskılandığı gözlenmiştir. Kız bebeklere ait diyabetik plasentalarda hem plasental ağırlığın, hem de mTOR, 4EBP1, VEGF ve VEGFR2 ekspresyonunun azaldığı, erkek plasentalarda anlamlı bir değişim olmadığı gözlenmiştir. Bu çalışma ile birlikte diyabette bozulan plasental vasküler homeostazda mTOR yolağının rol oynayabileceği ve cinsiyete bağlı olarak farklılıkların gözlenebileceği ilk kez ortaya konmuştur.
Plasental kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin kronik böbrek yetmezliğinde proliferasyon ve apoptoz mekanizmalarına etkisi
Kök hücreler normal gelişimin sürdürülmesinde ve erişkin doku rejenerasyonunda birden çok role sahip olan hücrelerdir. Erişkin kök hücreler, hayat süresi sınırlı olan hücrelerin yenilenmesini böylece organların bütünlüğünün sağlanmasını ve hasara yanıt vererek hasar görmüş dokuların rejenerasyonunu sağlarlar. Erişkin kök hücrelerden biri olan mezenkimal kök hücreler, birden fazla hücre serisine farklılaşabilirler ve kendilerini yenileyebilirler. Osteositlere, kondrositlere ve adipositlere farklılaşabilen hücrelerdir. Bir çok çalışmada plasenta mezenkimal kök hücre (MKH) kaynağı olarak gösterildiği gibi, aynı zamanda göbek kordonu stroması, amniyon sıvısı ve amniyon zarı gibi bileşenler de MKH kaynağı olarak gösterilmektedir. Daha önceki çalışmalarda amniyotik membranın kondrojenik, osteojenik ve adipojenik farklılaşmaya giden mezenkimal kök hücrelerden zengin olduğu gösterilmiştir. Kronik böbrek yetmezliğinin (KBY) özelliği, sağlıklı dokunun erozyonu ve fibrozis nedeniyle zaman içerisinde sürekli olarak böbrek fonksiyonlarının kaybıdır. Daha önceki çalışmalarda, hasarı takiben böbreğin yenilenme kapasitesi, zarar gören tübüler hücrelerin değiştirilmesi olarak gösterilmektedir. MKH'lerin tübüler epitel hücrelerine farklılaştığı, böylece renal yapı ve fonksiyonunun yenilendiği gösterilmiştir. Ayrıca MKH'lerin KBY'de renal fonksiyonu koruduğu ve böbreğe yerleşerek ve büyüme faktörlerini salgılayarak renal hasarı engellediği gösterilmiştir. Aristolohik asit (AA) KBY'ye neden olmaktadır. Morfolojik olarak, AA, tübüler atrofiye sebep olan interstisyal fibrozis ile karakterizedir. Bu çalışmada da sıçanlara AA uygulanarak KBY modeli oluşturulmuştur. Amniyon membranından izole edilen mezenkimal kök hücreler, deney grubundaki her bir sıçana 6x10⁵ hücre olarak kuyruk venlerinden transplante edilmiştir. 30 gün ve 60 gün süren iyileşme dönemi sonunda proliferasyon belirteçleri olan PCNA ve Ki67 proteinlerinin ekspresyonuna bakılmış ve kök hücre gruplarında bu proteinlerin ekspresyonu KBY grubuna göre artış göstermiştir. Ayrıca KBY grubunda kök hücre verilen gruplara göre apoptotik PARP'ın ekspresyonunun arttığı gösterilmiş ve TUNEL yöntemiyle de desteklenmiştir. Bunun yanında yine KBY grubunda hücre siklus inhibitörü proteinlerinden olan p57'nin ekspresyonunun kök hücre ve sham gruplarına göre arttığı da gösterilmiştir. Bu çalışma ile birlikte insan plasentasından elde edilen mezenkimal kök hücrelerin kronik böbrek yetmezliği sonucu oluşan fibrozisin onarılmasında proliferasyon ve apoptoz mekanizmalarında etkili olduğu gösterilmiştir.
Plasenta akreata spektrumlu gebeliklerde gerçekleşen aşırı trofoblast invazyonunda αvβ3 integrin ve CD9 etkileşiminin etkisinin araştırılması
Amaç: Plasenta Akreata Spektrumu (PAS), aşırı trofoblast hücre invazyonu ile karakterize olup anormal trofoblast hücre migrasyonunu içermektedir. Bu çalışmamızda ekstra villöz trofoblast hücrelerinin invazyonunda αVβ3 integrin ve CD9 moleküllerinin hücre-hücre etkileşimlerine bağlı rollerini belirlemeyi amaçladık. Yöntem: Plasenta Akreata Spektrumlu (PAS) gebelikler, Sezaryen doğum gebelikleri ve Kontrol grubu olmak üzere 3 çalışma grubu oluşturuldu. PAS grubu için hastalardan doğumu takiben histerektomi materyalleri veya term plasenta, Sezeryan ve Kontrol gruplarından ise term plasentalar alındı. Doku örneklerinde morfolojik analiz sonrasında Ekstravillöz Trofoblastların (EVT) karakterizasyonu için epitel belirteci olan Sitokeratin 7 (CYT7) ve desidual hücreler için mezenkimal hücre belirteci olan Vimentin kullanılarak αVβ3 integrin ve CD9 antikorlarıyla çiftli immünfloresan boyamalar gerçekleştirildi. Böylece proteinlerin hücrelerdeki ekspresyon şiddetleri ve lokalizasyonları belirlendi. Ayrıca aynı gruplara ait doku örnekleri ile αVβ3 integrin ve CD9 için Western Blot analizi gerçekleştirilerek gruplar arasındaki protein ekspresyon farklılıkları kantitatif olarak tespit edildi. Bulgular: Sezaryen doğum grubunda αVβ3 integrin protein miktarı PAS grubuyla mukayese edildiğinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma tespit edildi. Western Blot deneyleri sonucunda CD9 proteinin gruplar arasında anlamlı bir fark içermediği belirlendi. Yapılan çiftli immünfloresan boyanmalarda CD9 proteininin EVT'lerde ve villöz trofoblastlarda yüksek oranda eksprese edildiği tespit edildi. αVβ3 integrin ise Kontrol ve PAS gruplarının EVT'lerinde yüksek düzeylerde ekspre edilirken villöz trofoblastlarda da immün pozitif reaksiyon gösterdi. Sonuç: Sezaryen doğum sonucu endometriyumda oluşan skar yapısı, sonraki gebeliklerde EVT hücrelerinde artan αVβ3 integrin ekspresyonunu aracılığıyla PAS gelişiminde rol oynayabilir. Anahtar Kelimeler: Plasenta Akreata Spektrumu (PAS), Ekstravillöz Trofoblast, Trofoblast İnvazyonu, αVβ3-İntegrin, CD9, Plasental İmplantasyon Defektleri
Preeklamptik plasentalarda doğal lenfoid hücrelerin ekspresyon düzeylerinin değerlendirilmesi
Amaç: Preeklampsi, plasentasyonun tam olarak gerçekleşememesi ve immün tolerans ile ilişkili bir hastalıktır. Günümüze kadar yapılan bir çok çalışma da Doğal Lenfoid Hücrelerin (ILC) spiral arterlerin yeniden düzenlenmesinde, immün toleransın sağlanmasında, desiduanın gebeliğe uygun hale getirilmesinde ve homeostazin da önemli roller aldığı tespit edilmiştir. Preeklampsi durumunda plasentadaki ekspresyon düzeylerinin normal gebeliğe göre değişip değişmediği bilinmemektedir. Preeklampsi vakalarında, ILC'lerin plasentada bulunma düzeylerinin trofoblast invazyonunu etkileyerek spiral arterlerin yeniden düzenlenmesinde anormalliğe neden olacağı ve böylece homeostazı bozarak kan basıncında anormalliklere neden olacağı hipoteziyle, normal gebeliklere göre preeklamptik gebeliklerde ILC'lerin ekspresyonlarında farklılar olabileceğini düşünmekteyiz. Yöntem: Kontrol grubu (term plasenta örnekleri, n=6), hafif preeklampsi gurubu (term plasenta örnekleri, n=6) ve ağır preeklampsi grupları (term plasenta örnekleri, n=6) oluşturuldu.. Hematoksilen-Eozin boyaması yapılarak normal ve preeklamptik plasenta morfolojileri belirlenmiştir. Preeeklamptik ve sağlıklı gebeliklerdeki plasentalarda mevcut olan ILC'lerin sayısal değerini belirlemek için ILC1, ILC2 ve ILC3 tipleri için flow sitometri deneyleri yapılmıştır. Bulgular: Morfolojik olarak, preeklamptik plasentalar çok sayıda sinsisyal nodlar, fibrin birikimleri, kalsifikasyon alanları ve trofoblast hücre dökülmeleri ile karakterizedir. Flow sitometri sonuçlarımıza göre, ILC1'lerin ekspresyonunda gruplar arasında fark görülmemiştir (p>0.05). ILC2 ekspresyonu ise kontrol gurubu ile mukayese edildiğinde, hafif ve ağır preeklampsi gruplarında istatiksel olarak anlamlı artış (p<0.05) göstermiştir. ILC3 ekspresyonu ise kontrole kıyasla ağır preeklampsi grubunda istatiksel olarak anlamlı artış (p<0.05) göstermiştir. Sonuç: Preeklamptik plasentalarda sağlıklı plasentalara göre ILC1'in sayısal miktarı farklılık göstermezken, ILC2 ve ILC3 hücrelerin sayılarında artış mevcuttur. Özellikle preeklampsinin şiddeti artıkça ILC3 hücrelerin sayısındaki artış istatistiksel olarak daha anlamlı bir şekle dönüşmektedir.
Preeklamptik plasentalarda T yardımcı-22 (TH22) ve T yardımcı-17 (TH17) hücrelerinin araştırılması
Amaç: Preeklampsi, gebelik esnasında en sık rastlanan gebelik komplikasyonlarından biridir. Ekstravillöz Trofoblast (EVT) hücrelerinin maternal spiral arterlere invaze olması ve damarları yeniden şekillendirmesiyle birlikte embriyo gelişimi için gerekli tüm metabolitleri anneden sağlamaya devam eder. İmplantasyon esnasında ve sonrasında materno-fetal immün sistemin dengede olması EVT invazyonunun kontrol edilebilmesi için önemlidir. Yardımcı T hücreleri (Th) salgıladıkları sitokinlerle desidual mikroçevrenin proinflamatuvar olmasına neden olabilirler. Bu çalışmada immün sistemde proinflamatuvar yanıtta rol alan Th17 ve Th22 hücrelerine, özgün RORγ (RAR-ilişkili Orphan Reseptör Gamma) ve AHR (Aryl hidrokarbon reseptör) proteinlerinin ve yardımcı T hücrelerine özgün CD4 (Cluster of Differentiation 4) proteininin preeklamptik ve normal plasenta dokularındaki görevleri ve lokalizasyonları araştırılmıştır. Yöntem: Preeklamptik plasentaların morfolojik analizi için Hematoksilen-Eosin boyamaları yapılmıştır. Western Blot (WB) yöntemi ile RORγ ve AHR proteinlerinin preeklamptik ve kontrol plasentalardaki protein miktarları kantitatif olarak belirlenmiştir. İmmünfloresan (IF) yöntemi yapılarak, RORγ, AHR ve CD4 boyamalarıyla Th17 ve Th22 hücrelerinin preeklamptik ve kontrol plasentadaki ekspresyon şiddetleri ve lokalizasyonları tespit edilmiştir. Bulgular: WB deneyleri sonucunda preeklampsi grubunun kontrol grubuna göre AHR protein miktarında istatistiksel olarak anlamlı bir artış tespit edilmiştir (p≤ 0.05). RORγ protein miktarında ise gruplar arasında istatistiksel olarak bir fark belirlenmemiştir (p ≥ 0.05). Term plasentasında CD4 ve AHR immünfloresan boyanma gösteren hücrelerin preeklampsi grubunda kontrol grubuna göre daha çok sayıda lokalize oldukları tespit edilmiştir. RORγ boyanma gösteren hücrelerin ekspresyonlarında bir fark tespit edilmemiştir. Sonuç: Preeklampside oluşan immün denge bozukluğunda ekspresyonlarında istatistiksel olarak bir artış tespit edilen Th22 hücreleri rol oynayabilir.
Stevia rebaudiana bertoni'nin diyabetik sıçanlarda periferal kanda tümör nekroz faktör alfa ve interlökin-1 beta aracılığıyla immünmodulatöretkisinin araştırılması
Amaç: Stevia rebaudiana (SR), günümüzde düşük kalorili bir tatlandırıcı olması ve kandaki glukoz düzeyini düşürmesi nedeniyle diyabet ve obezite tedavilerinde alternatif olarak kullanılan bir bitkidir. Diyabet aynı zamanda otoimmün düzensizlikleri de içeren ve hastada aşırı immün cevaba takiben birçok lezyona sebep olan bir hastalıktır. Bu çalışma stevianın diyabet ile ilgili immünmodülatör özelliklerini araştırmayı amaçlamaktadır. Yöntem: 150-250gr ağırlığındaki wistar sıçanlara streptozotosin (STZ) enjeksiyonu ile diyabet modeli oluşturuldu. Diyabet olan ve olmayan stevia gruplarını oluşturan sıçanlara 28 gün boyunca her gün 2 ve 25 mg/kg stevia gavaj yoluyla verildi. 28. günün sonunda ELISA yöntemi ile serumdaki IL-1β ve TNF-α miktarı belirlendi. Ayrıca T lenfosit, yardımcı T lenfosit ve sitotoksik T lenfosit hücrelerinin sayıları da akım sitometri yöntemi ile tespit edildi. Bulgular: Sıçanların ağırlıklarındaki artış diyabet grubu ile kıyaslandığında diyabet + 25 mg/kg stevia grubunda istatistiksel olarak anlamlı idi. Kan glukoz değeri, diyabet + 25 mg/kg stevia grubunda diyabet grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde azaldı (p≤0,05). IL-1β ve TNF-α sitokin seviyeleri diyabet +25 mg/kg stevia grubunda diyabet grubuna göre anlamlı olarak azaldı (p≤0,01). CD8+ sitotoksik T hücre sayıları, diyabet + 25 mg/kg stevia grubunda, diyabet grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde azaldı (p≤0,05). Sonuç: T Hücrele sayılarında ve proinflamatuar sitokin seviyesinde meydana gelen değişimler diyabetin bir otoimmün hastalık olduğunun göstergesidir. Stevianın, CD3+ , CD4+, CD8+ T hücreleri ve IL-1β, TNF-α sitokinleri üzerindeki etkisi, stevianın immünomodulatör etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Stevia, Diyabet, Sitokin, Lenfosit
Hiperglisemik koşullarda insan umbilikal kord venöz endotel hücrelerinde otofaji mekanizmasının araştırılması
Amaç: Hiperglisemi, kanda aşırı miktarda glukoz bulunmasıyla karakterize bir durumdur. Damarların yapı taşı olan endotel hücreleri, hiperglisemiye karşı oldukça duyarlıdır. Otofaji, açlık ve stres koşullarında hücrenin hayatta kalma ve enerji metabolizmasını düzenleyen bir mekanizmadır. Bu çalışmada hiperglisemik koşullarda insan umbilikal kord venöz endotel hücrelerindeki (HUVEC) otofaji mekanizmasının incelenmesi amaçlanmıştır. Yöntem: İnsan umbilikal kord venöz endotel hücreleri, göbek kordonun venlerinden izole edildi ve farklı glukoz konsantrasyonlarına (5, 17, 25 mM Glukoz) sahip hücre besiyerlerinde 24, 48 ve 72 saat inkübe edildi. İnkübasyon işleminin sonunda hücreler Western Blot ve Real Time PCR analizleri için hazırlandı ve otofaji belirteçleri olan LC3, p62 ve Beklin-1, gen ve protein seviyeleri gruplar arasında karşılaştırıldı. Bulgular: 24 saat hiperglisemik gruplardaki LC3 miktarı, kontrole kıyasla anlamlı derecede azaldı. 48 saat hiperglisemik gruplarda LC3 miktarı, kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı derecede arttı. 72 saat hiperglisemik gruplardaki Beklin-1 ve LC3 miktarları, kontrole kıyasla anlamlı olarak arttığı tespit edildi. p62 protein miktarının ise 72 saat hiperglisemik gruplarda, kontrole kıyasla anlamlı derecede azaldığı belirlendi. Sonuç: İlk 24 saatte hiperglisemiye bağlı olarak hücrelerde otofajinin azalması, glukoz aracılığıyla otofajinin inhibe olduğunu göstermektedir. Ancak 48 ve 72. saatlerde otofajide artış tespit edilmiştir. Otofaji artışının nedeni hiperglisemik ortama maruz kalma süresinin uzamasıdır. Sonuç olarak HUVEC hücrelerinde otofaji mekanizması zamana ve maruz kaldığı glukoz miktarına göre değişim göstermektedir. Anahtar Kelimeler: hiperglisemi, insan umbilical kord venöz endotel hücreleri, otofaji
Sıçanlarda oluşturulan fokal serebral iskemi ve reperfüzyon modelinde insan trofoblast progenitör hücrelerinin beyindeki glukoz transport mekanizmasına etkileri
Amaç: Bu çalışmada amacımız, sıçanlar ile oluşturulan fokal serebral iskemi (FSİ) ve reperfüzyon modeli sonrasında insan trofoblast progenitor hücre (iTPH) enjeksiyonunun sıçanların beynindeki glukoz transport mekanizması ve glukoz metabolizmasını nasıl etkilediğini belirlemektir. Bu mekanizmalara bağlı olarak iTPH'ler ile alternatif bir hücresel tedavi yönteminin geliştirilmesi konusunda literatüre katkı sağlamaktır. Yöntem: Wistar sıçan beyinlerinde geçici orta serebral arter tıkanıklığı ile FSİ-reperfüzyon modeli oluşturulmuştur. Sıçanların kuyruk venlerinden iTPH enjekte edilip hayvanlar sakrifiye edilerek dokuları üzerinde analizler gerçekleştirilmiştir. GLUT1, GLUT3, GLUT4, IR ve IGF-1R protein miktarlarının FSİ durumunda ve iTPH enjeksiyonuyla birlikte nasıl değiştiği Western Blot analizleri ile incelenmiştir ve ekspresyonları immünofloresan yöntemi ile gösterilmiştir. Bulgular: GLUT1, GLUT3 ve GLUT4 protein miktarları FSİ 1. günde artış gösterirken, FSİ'nin ilerleyen günlerinde sham gruplarına benzer protein miktarına sahiptirler. FSİ-iTPH 3. günde ise FSİ 3. gün gruplarına göre azaldıkları tespit edilmiştir. GLUT1 ve GLUT4 proteinlerinin FSİ-iTPH 11. günde FSİ-11'inci gün ile benzer miktarda olduğu belirlenmiştir. GLUT3 proteini ise FSİ-iTPH 11. günde FSİ-11. güne kıyasla daha fazla miktardadır. IR protein miktarı FSİ 3. günde azalırken, FSİ 11. günde artış göstermiştir. Ancak FSİ 11. günde sham gruplarına göre düşük seviyededir. iTPH enjeksiyonu ile birlikte IR protein miktarı FSİ gruplarına göre artmıştır. IGF-1R protein miktarı FSİ 1. günde artarken, FSİ'nin ilerleyen günlerinde sham gruplarına yaklaşmıştır ve iTPH enjeksiyonu ile birlikte FSİ gruplarına kıyasla artış göstermiştir. GLUT1, GLUT3, GLUT4, IR ve IGF1R için gerçekleştirilen immünofloresan boyanmaları bu sonuçları destekler niteliktedir. Sonuç: FSİ durumunda beyindeki glukoz transport mekanizması ve glukoz metabolizması etkilenmektedir. iTPH'ler FSİ durumunda beyindeki glukoz transportunu ve metabolizmasını düzenleyebilirler.
Normal ve in vitro fertilizasyon sonucu gerçekleşen gebeliklerin plasentalarında hücre siklus mekanizmasının incelenmesi
Amaç:Bu çalışmanın amacı normal gebeliklerde, TET ve DET sonucu gerçekleşen gebeliklerde, gelişen plasental değişikliklerde, plasentasyonla ilişkili hücre siklus proteinlerinin araştırılmasıdır. Yöntem: Normal gebelik, TET ve DET sonucu gerçekleştirilmiş gebeliklerden elde edilen plasenta dokuları üzerinde IHK ve WB deneyleri gerçekleştirilmiştir. Kontrol, TETP ve DETP gruplarında, PCNA, siklin D3 ve p57 proteinlerinin miktarları ve plasental hücrelerdeki immunolokalizasyonları tespit edilmiştir. İstatistiksel analizler yapılmıştır. Bulgular: WB analizlerine göre PCNA protein miktarı TETP grubuna kıyasla DETP grubunda istatistiksel olarak anlamlı şekilde arttığı belirlenmiştir. Siklin D3 protein miktarının, kontrol grubuna kıyasla DETP grubunda istatistiksel olarak anlamlı şekilde arttığı tespit edilmiştir. p57 protein miktarı TETP grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak azalmıştır. İHK deney sonuçlarına göre PCNA proteini boyanma sıklığı en yüksek DETP grubu sitotrofoblast hücrelerindedir. PCNA proteini üç grup için de sitotrofoblast ve stromal hücrelerde immünreaktivite göstermektedir. Endotel hücrelerinde ise PCNA boyanması mevcut değilken sinsisyotrofoblastlar için sadece TETP grubunda reaksiyon gözlenmektedir. Siklin D3 proteininin boyanma sıklığının sitotrofoblast hücrelerinde kontrole kıyasla DETP ve TETP gruplarında arttığı tespit edilmiştir. Stromal hücrelerde, KP, TETP ve DETP gruplarında immünreaktivite gözlenirken, sinsisyotrofoblast ve endotel hücrelerinde siklin D3 boyanması mevcut değildir. p57 için ise, sitotrofoblast ve stromal hücrelerde, en yüksek immünoreaktivite kontrol grubunda gözlenirken, sinsiyotrofoblast ve endotel hücrelerinde boyanma tespit edilmemiştir. Sonuç: YÜT ile taze ve dondurulmuş embriyo transferi sonucu gerçekleşen gebeliklerin plasentalarInda hücre döngüsü mekanizması farklılık göstermektedir. Bu sonuçlar YÜT'ün sebep olduğu patolojik olgularla ve DET ile TET sonucu gerçekleşen gebeliklerin başarı oranları ile ilişkili olabilir.
Normal ve in vitro fertilizasyon sonucu gerçekleşen gebeliklerin plasentalarında vaskülogenez ve anjiyogenez mekanizmalarının incelenmesi
Amaç: Bu projede taze embriyo transferi ve dondurulmuş embriyo transferi sonucu oluşan gebeliklerden elde edilen term plasentalarda, anjiyogenez faktörlerinden VEGF, VEGFR-2, CD34 proteinlerinin araştırılması amaçlanmıştır. Yöntem: Normal gebelik, in vitro fertilizasyon sonucu gerçekleşen gebeliklerde doğum sonrası elde edilen plasentalar toplanıp gruplandırıldı. Plasentaların bir kısmı rutin ışık mikroskopi takibi yapılarak histolojik kesitler alındı. Bu kesitlere immünohistokimyasal boyama uygulandı ve araştırılan proteinlerin lokalizasyonu belirlendi. Dokuların diğer kısmıyla Western Blot deneyleri için gerekli protokoller gerçekleştirildi. İstatistiksel analizler yapıldı. Bulgular: VEGF protein miktarı için kontrol gurubu, DETP gurubu ve TETP grupları arasında istatistiksel olarak bir fark yoktu. VEGFR2 protein miktarının DETP grupunda diğer guruplara göre istatistiksel olarak daha yüksek olduğu tespit edildi. CD34 protein miktarı ise Kontrol gurubunda diğer guruplara göre istatistiksel olarak daha fazla olduğu belirlendi. Yapılan immünohistokimyasal deneyler sonucunda VEGF, VEGFR2 ve CD 34 proteinlerin immuno lokalizasyonları, tüm guruplarda fakat farklı yoğunluklarda sitotrofoblast hücrelerinde, sinsisyotrofoblast hücrelerinde, villus stromal hücrelerde, villüs endotel hücrelerinde immuno pozitif reaksiyon gösterdiği tespit edildi. Sonuç: Bulgularımız sonucunda araştırmış olduğumuz VEGF, VEGFR2, CD34 proteinlerinin tümünde DETP grubu ekspresyon miktarları TETP grubuna kıyasla daha yüksektir. Anahtar Kelimeler: yardımcı üreme teknikleri, in vitro fertilizasyon, plasenta, dondurulmuş embriyo transferi, taze embriyo transferi.
Sıçanlarda oluşturulan fokal serebral iskemi modelinde insan trofoblast progenitör hücrelerinin anjiyogenez mekanizmasına etkileri
Amaç: İnme sonrası merkezi sinir sisteminde (MSS) insan trofoblast projenitör hücrelerin (hTPC) transplantasyonunun anjiyogenez, vasküler yeniden modellenme ve nörogenez mekanizmalarını teşvik edebileceği, böylece iskemik alana oksijen ve besin taşınmasını sağlayabileceği ve devamında ise inme sonrası sekonder hasarın önlenmesini sağlayabileceği hipotezini araştırdık. Yöntem: İnsan trofoblast progenitör hücreleri term plasentalardan izole edilip akım sitometresi ve immünohistokimyasal boyanmalarla karakterize edildi. Sıçanlarda inme modeli MCAO ile oluşturulup 24 saat sonrasında kuyruk veninden hTPC enjeksyonu gerçekleştirildi. İnme sonrası 3. gün ve 11. günlerde hayvanlar sakrifiye edildi. %2 TTC ve Luxol Fast Blue boyanması ile hasar tespiti yapıldı. Devamında hTPC'lerde VEGF, VEGFR1 ve VEGFR2 proteinlerinin ve mRNA ekspresyonları sırasıyla Western Blot ve qRT-PCR metodlarıyla ile tespit edildi. Son olarak, iskemik hasar oluşturulmuş beyin dokularında trofoblastik kök hücre transplantasyonu öncesi ve sonrası anjiyogenezle ve nörogenezle ilgili protein miktarı Western Blot ile belirlendi ve bu proteinlerin ekspresyonları ve lokalizasyonları immünohistokimya ile tespit edildi. Bulgular: İzole edilen hücrelerle yapılan karakterizasyon çalışmaları sonucunda bu hücrelerin trofoblast progenitor hücreleri olduğu belirlendi. İnfarkt bölgesi ve demiyelinizasyon hTPC enjeksiyonu yapılan gruplarda azalmıştır. hTPC'ler VEGF,VEGFR1 ve VEGFR2 ekspresyonunu mRNA ve protein düzeyinde gerçekleştirirek anjiyogenezde rol alırlar. Transplantasyon sonrasında beyin dokularında Western Blot sonuçlarına göre DLX5 ve VEGF transplantasyon sonrası 11. günde ve NKX2.2 transplantasyon sonrası 3. ve 11. günlerde anlamlı olarak artarken; LHX6, Olig1, PDGFRα, VEGFR1 ve VEGFR2 de anlamlı olmayan artışlar saptanmıştır. Sonuç: Trofoblast progenitör hücreler inme sonrası sıçan beyninde anjiyogenik ve nörogenik faktörlerin ekspresyonunu artırır. hTPC inme onarımında terapötik olarak rol oynayabilir.
Plasentada ekstrasellüler matriks kompozisyonu tarafından HIF'in aktivasyonu
Amaç: Kadınlarda morbidite ve mortaliteye neden olan bir gebelik hastalığı olan preeklampsinin (PE'nin) uterus ekstrasellüler matriks (ESM) yeniden modellenmesi ve HIF fonksiyonundaki bozukluklar ve yetersiz trofoblast invazyonu ile bağlantılı olduğu gösterilmiştir. Fare trofoblastik kök hücrelerin (TKH'lerin) kültüre edildiği ESM'nin, MAPK sinyal yolağıyla HIF'i tetikleyebildiğine dair bulgular bulunmaktadır. Çalışmamızda, fare kültürü çalışmaları sonucunda elde edilen ESM indüklü MAPK-HIF ilişkisinin normal ve PE insan plasentalarında incelenmesini amaçladık. Yöntem: Normal ve PE term plasentalarda fibronektin, β3 integrin, fosfo-MAPK3/1, HIF-1α, HIF-lβ, HIF-2α proteinleriyle ikili immünoflorasan boyamalar yapılarak bu proteinlerin birlikte ekspresyonları analiz edildi ve hücresel dağılımları belirlendi. Plasentalarda fibronektin, β3 integrin, HIF-lα, HIF-lβ, HIF-2α ve beta aktinin protein ve mRNA düzeyindeki ekspresyonları sırasıyla Western blot ve qRT-PCR analizleriyle değerlendirildi. Western blot yöntemiyle MAPK3/1 ve fosfo-MAPK3/1 proteinlerinin ve qRT-PCR ile de MAPK1 ve MAPK3 mRNA'larının ekspresyonları da incelendi. Bulgular: PE plasentalarda fibronektin ve β3 integrinin mRNA ve protein düzeyindeki ekspresyonları normale göre değişmezken HIF ekspresyonları hem mRNA hem de protein düzeyinde normale göre arttı. PE plasentalarda MAPK1 ekspresyonu mRNA düzeyinde normalden fazla bulunurken protein düzeyinde değişmedi. MAPK3'in ise mRNA ve protein düzeyindeki ekspresyonları gruplar arasında aynı bulundu. Normal ve PE plasentalarda fibronektin ile HIF proteinlerini, β3 integrin ile HIF proteinlerini ve fosfo-MAPK3/1 ile HIF proteinlerini beraber eksprese eden hücreler tespit edildi. Sonuç: Çalışmamızda ESM indüklü MAPK-HIF yolağının normal ve PE insan plasentalarında geçerli olabileceğine dair kanıtlar ilk kez ortaya konmuştur. İnsan plasentasında ESM indüklü MAPK-HIF yolağının varlığının kesinleşmesi ve bu yolağın plasental hücrelerin farklılaşmasındaki rolünün anlaşılması için kapsamlı çalışmalar gerekmektedir. Anahtar Kelimeler: plasenta, preeklampsi, ekstrasellüler matriks, MAPK, HIF
Stevioside'nin diyabetik sıçan plasentasında glukoz taşınımında rol alanGLUT1, GLUT3 ve GLUT4 ekspresyonları üzerine etkisi
Amaç: Plasentanın temel görevlerinden biri de materno-fetal besin taşınımını sağlamaktır. Embriyo gelişimi için birincil enerji kaynağı glukoz olup plasentada mevcut olan glukoz taşıyıcı (GLUT) proteinler aracılığıyla anneden fetüse taşınmaktadır. Stevia bitkisi uzun zamandır doğal tatlandırıcı ve tıbbi amaçlı olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmanın amacı; Stevioside'nin normal ve diyabetik hayvanlarda, kan glukoz ve serum insülin düzeyine etkisini belirlemektir. Ayrıca, Stevioside'nin, normal ve diyabetik sıçan plasentasında glukoz taşınımında rol alan GLUT1, GLUT3 ve GLUT4 proteinlerine etkilerini belirlemektir. Yöntem: Erkek ve dişi sıçanlar kafeste bir gece bırakıldıktan sonra dişi deneklere vajinal simir yapıldı. Simirlerinde sperm gözlenen dişi sıçanların gebeliğin sıfırıncı gününde olduğu kabul edildi. Kontrol, stevioside, diyabet ve diyabet + stevioside grupları oluşturuldu. Elisa yöntemi ile kandaki insülin miktarı belirlendi. Plasentada GLUT1, GLUT3 ve GLUT4 proteinlerinin ifadeleri immunohistokimya ile bu proteinlerin miktarları ise western blot yöntemi ile tespit edildi. Bulgular: GLUT1 proteini, gebeliğin 15. gününde diğer gruplar ile karşılaştırıldığında diyabet + stevioside grubunda istatistiksel olarak (p<0,05) anlamlı oranda azaldı. 20. gününde ise diyabet grubunda diğer gruplara göre (p<0,05) anlamlı oranda arttı. GLUT3 proteini gebeliğin 15. gününde stevioside grubunda artış gösterirken diğer gruplar arasında bir fark yoktu. 20. günde ise diyabet grubu, stevioside ve diyabet + stevioside grubuna göre artarken kontrol grubu ile karşılaştırıldığında bir fark yoktu. GLUT4 proteinin gebeliğin 15. gününde diyabet grubunda kontrol ve stevioside gruplarına göre anlamlı oranda artarken diyabet + stevioside grubuna göre fark yoktu. 20. günde GLUT4 proteini için gruplar arasında bir fark mevcut değildi. Elisa bulgularına göre insülin miktarı gebeliğin 15. ve 20. gününde diğer gruplar kontrol grubuyla karşılaştırıldığında istatiksel olarak anlamlı oranda azaldığı belirlendi (p<0,05, p<0,01, p<0,005). Sonuç: Sıçan plasentalarındaki GLUT proteinlerinin ekspresyonundaki değişimler fetüsü korumaya yönelik bir mekanizma olabilir ve Stevioside'nin plasentaya etkisi sınırlı olabilir.