Barsak enflamasyonu oluşturulan hücre kültür modelinde, timokinonun biyolojik aktiviteleri ile metabolomik profillemesinin araştırılması

Gastrointestinal sistem (GIS), vücutta sindirim işlemini düzenleyen ve besin maddelerinin emilimini sağlayan anatomik ve fonksiyonel bir sistemdir. GIS boyunca hücresel bariyer hattı oluşturan barsak epiteli mukozal hemostazın korunmasında oldukça önemlidir. Barsak epiteli, besin emilimini gerçekleştirmenin yanında, mukus, antimikrobiyal peptidler ve sIgA üreterek bağışıklık üzerine de etki eder. Ancak, bazı durumlarda barsakların normal işlevleri enflamasyon adı verilen, dengeli olduğu takdirde organizmayı doku hasarından koruyan bir süreçle etkilenebilir. Enflamasyon, vücudun zararlı etkenlere veya yaralanmalara karşı savunma mekanizmasıdır. Ancak, kronik enflamasyon (uzun süreli ve aşırı enflamasyon) GIS'i olumsuz etkileyebilir. Barsaklardaki kronik enflamasyon, başta enflamatuvar barsak hastalığı (EBH) olmak üzere bir dizi kronik hastalığa sebep olabilir. EBH, gastrointestinal sistemin kronik ve tekrarlayan bir enflamasyonu olarak bilinir ve enflamasyona sebep olarak reaktif oksijen türleri/reaktif nitrojen türleri (ROT/RNT) artışı, Nf-B yolak aktivasyonu gösterilse de patogenezi tam olarak anlaşılamayan bir durumdur. Ayrıca EBH genetik yatkınlıkla da ilişkilendirilmiş, remisyon ve alevlenme dönemleri ile giden, ekstraintestinal belirti ve bulguların mevcut olduğu ve uzun vadede malignite riski taşıyan hastalıklardır. EBH patogenezi tam olarak bilinmediği gibi, tanısında kesin bir biyobelirteç bulunamamıştır. Son dönemlerde biyobelirteç çalışmalarında, doku, biyolojik sıvı veya hücre özütünün metabolitlerini, niteliksel ve niceliksel olarak karakterize etmek için proton nükleer manyetik rezonans [1H-NMR] spektroskopisi veya kütle spektrometrisi [MS] gibi analitik kimya tekniklerinin oldukça sık kullanıldığı metabolomik çalışmalardan faydalanılmaktadır. EBH moleküler patogenezi ve biyobelirteç tayininde de birçok metabolomik çalışma yapılmış, sonuçlarda enflamatuvar biyomoleküller ön planda anlamlı yüksek bulunmuş ancak net bir biyobelirteç ya da patogenez tayini saptanamamıştır. EBH tedavisinde sadece enflamasyonu kontrol altına almaya yönelik kortikosteroidler gibi ilaçlar mevcut olup bu ilaçlar da ciddi yan etkilere sahiptir. Bu ilaçlardan olan ve güncel tez çalışmasında da kullanılan budesonid barsak enflamasyonunu kontrol altına alabilmenin yanında, immünbaskılama, osteoporoz gibi ciddi yan etkilere sahiptir.İlaçların bu istenmeyen etkileri yan etki profili daha düşük olan ajanların arayışına yol açmıştır. Antioksidan, anti-enflamatuvar, immunomodülatör özellikleriyle bilinen polifenoller EBH başta olmak üzere enflamatuvar hastalıkların tedavisi için bilimsel çalışmalara çokça konu olmuştur. Bu polifenolik bileşiklerden olan timokinon (TQ) Nigella sativa (çörek otu)nın ana bileşeni olup ciddi antioksidan ve antienflamatuvar özellikleri olduğu önceki çalışmalarla gösterilmiştir. Çalışma ile amacımız, hücre kültürü ile barsak enflamasyonu modeli oluşturarak TQ'nun anti-enflamatuvar terapötik etkinliğini, yüksek çözünürlüklü NMR spektoskopisi ve LC-MS/MS kullanarak hastalık metobolomik profillemesini yaparak araştırmak ve bir anti-enflamatuvar ajan olan budenosid ile karşılaştırmaktır. Bunun için öncelikle lipopolisakkarit (LPS) verilerek Raw 264.7 makrofaj hücrelerinde enflamasyon oluşturulmuş, ardından bu enflamasyonlu besiyeri alınarak HT-29 kolon kanseri hücreleri üzerine verilmiştir. Böylece hücre kültüründe barsak enflamasyon modeli tasarlanmış, ardından bu model üzerinde TQ ve budesonidin etkileri incelenmiştir. Enflamasyon gelişiminde ana mediyatörlerden olan ROT ile RNT enflamasyon grubunda anlamlı derecede yüksek bulunmuş, TQ uygulanmasıyla bu türlerin seviyeleri düşmüş ancak en yüksek düşüş budesonid grubunda saptanmıştır. Yine EBH patogenezinde önemli rol oynayan sıkı bağlantı proteinleri, okludin ve klaudin-5 proteinlerinin ifade seviyeleri TQ gruplarında artmış, budesonid grubunda en yüksek artış görülmüştür. Tüm bu sonuçlar TQ'nun anti-enflamatuvar ve doku iyileştirici etkisinin olduğunu bize göstermiştir. NMR ile yapılan metabolomik analizlerde enflamasyon grubunda kontrole göre ksantin metaboliti anlamlı seviyede düşüklük göstermiş, yolak zenginleştirme analiziyle daha ayrıntılı incelendiğinde pürin metabolik yolağının etkilendiği görülmüştür. Bu sonuç enflamasyon oluşumunun ksantin oksidaz enziminin, pürin metabolik yolağındaki aktivasyonuna bağlanarak superoksit radikali üretimi üzerinden olabileceğini düşündürmektedir. HRMS ile bu sonuç doğrulanarak aynı metabolik yolağın etkilendiği bulunmuştur. Yine NMR analizinde; laktat, galaktarat fumarat ve dimetilamin düzeyleri enflamasyon grubunda kontrole göre artış göstermiş (VIP skoru > 1), glikolat, 2-hidroksiizobütirat, glisin, asetat, sitrakonat ise kontrol grubunda enflamasyon grubuna göre anlamlı artış (VIP skoru > 1) göstermiştir. Laktat artışı enflamasyon sırasında Warburg etkisine bağlı aerobik glikoliz yolağına kaymayı düşündürürken asimetrik dimetilarginin(ADMA) yıkım ürünü olan dimetilamin artışı, ADMA yıkım artışına bağlı NOS (nitrik oksit sentaz) inhibisyonunun ortadan kalktığını ve bunun enflamasyon oluşumuna katkıda bulunduğunu düşündürmüştür. Yine kontrol grubunda artan metabolitlerden olan glisinin glutatyon sentezinde rol alan aminoasitlerden olması, glikolatın serin ve glisin üzerinden antioksidan sistemi aktive eden metabolit olması, sitrakonatın ise güçlü Nrf2 aktivatörü olması bu metabolitlerin antioksidan ara metabolitleri olduğunu düşündürmektedir. TQ verilen enflamasyonlu gruplarla yapılan NMR analizinde genotoksik, apoptotik özellikleri bilinen N-nitrozodimetilamin (NDMA)'nın enflamasyon gurubuna göre anlamlı derecede düşük bulunduğu saptanmıştır. TQ verilen enflamasyonlu gruplarla yapılan NMR analizinde enflamasyon grubuna göre anlamlı metabolik yolak bulunamazken, HRMS ile nikotinat-nikotinamit metabolizmasının ve eter-lipid metabolizmasının anlamlı derecede etkilendiği görülmüştür. Yine bu iki yolağın budesonid verilen enflamasyonlu gruplarda, sadece enflamasyon oluşturulan gruba göre etkilenmiş olduğu bulunmuş ve bu sonuç TQ'nun anti-enflamatuvar etkisini bu yolaklar üzerinden gerçekleştirebileceğini düşündürmüştür. Sonuç olarak güncel çalışmada, barsak enflamasyonu oluşturulan hücre kültürü modelinde metabolitlerin analizinde NMR ve MS metotlarının birlikte kullanımı ile oldukça geniş metabolit spektrumu içeren metabolomik profilleme gerçekleştirilmiştir. Bu yolla TQ'nun antienflamatuvar etkisini hangi olası metabolik yolakla gerçekleştirebileceği tartışılmış ve yine enflamasyon sırasında farklılık gösteren metabolitler belirlenerek hücre kültürü ile biyobelirteç çalışmalarına zemin hazırlanmıştır. Ayrıca daha önce EBH hastalarından elde edilen metabolomik çalışmalarla kıyaslanarak benzer metabolit profilleri bulunmuş bu da hücre kültürürünün metabolomik analizlerde kullanılabilirliği tezini güçlendirmiştir. Her ne kadar benzer metabolit profilleri elde edilse de hücre kültürü ile elde edilen sonuçlar tam olarak insan metabolizmasını yanıstmadığı için ileri in vivo çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir. Anahtar Kelimeler: enflamasyon, timokinon, metabolomik, hücre kültürü