Bazı farmakolojik şaperonların mutant AVPR2 proteinlerinde gözlenen fonksiyon kayıpları üzerine etkilerinin araştırılması

Protein katlanmasındaki hatalar, anormal ya da olgunlaşmamış proteinlerin meydana gelmesine neden olmaktadır. Yanlış katlanmış proteinler agregatlar halinde birikmekte ve endoplazmik retikulumda toksik etki yaratmaktadırlar. Bu süreç, ilgili genlerdeki mutasyonların neden olduğu ve protein homeostatisini bozan konformasyonel hastalıklara neden olmaktadır. Çeşitli araştırma grupları, farmakolojik şaperon olarak adlandırılan küçük hücre-geçirgen moleküllerin, konformasyonel hastalıklar üzerinde terapatik etkiye sahip olduklarını göstermişlerdir. Bu küçük bileşikler, yanlış katlanmış proteinleri stabilize ederek doğal bir şekilde kendilerine özgü katlanmalarına izin vermektedir. Dolayısıyla işlevlerini geri kazanabilecekleri moleküler üç boyutlu formlarını kazanmalarına yardımcı bir iskelet oluşturmaktadırlar. Arjinin Vazopressin Reseptör 2 (AVPR2) ve onu kodlayan genlerde oluşan mutasyonlar; nadir bir hastalık olan X'e bağlı Nefrojenik Diabetes İnsipidus'a (NDI) neden olmaktadır. NDI'a neden olan AVPR2 genindeki mutasyonlar farklı fenotipte reseptör oluşumuna neden olabilirler. Ancak in vitro AVPR2 çalışmalarında, oluşan mutasyon sonucu yanlış katlanan ve endoplazmik retikulum kalite kontrol sistemine takılı kalan bu hücre içi reseptörlerin, apikal membrana ulaştıklarında fonksiyonel işlevlerini yerine getirebildikleri gösterilmiştir. Bu çalışmanın amacı; NDI hastalığına neden olan ve fonksiyon kaybına neden olduğu tespit edilen R68W, R67_G69/G107W (Compound hemizigot) ve T273M mutant AVPR2 proteinlerinin farmakolojik şaperon uygulamasıyla, kalite kontrol sisteminden kurtarılıp görev gördükleri apikal membrana ulaşma durumlarının araştırılmasıdır. Bu amaçla yapılan deneysel çalışmalarda, yabanıl tip ve mutant AVPR2 gen dizilerini içeren plazmidler COS-7 hücrelerine geçici transfeksiyon yöntemi ile aktarılmıştır. Transfekte mutant ve yabanıl tip COS-7 hücrelerine üç farklı farmakolojik şaperon, peptid olmayan antagonist OPC41061 (Tolvaptan), OPC31260 (Mozavaptan) ve OPC21268 uygulaması yapılmıştır. Mutant ve yabanıl tip AVPR2'lerin hücre içi ve hücre yüzeyi miktarlarının belirlenmesi için, hücre yüzey ELISA ve total ELISA yöntemi uygulanmıştır. Önceki çalışmalar kapsamında gerçekleştirilen mutant proteinlerin normal şartlar altında elde edilen sonuçları ile farmakolojik şaperon uygulama sonrasındaki ELISA sonuçları karşılaştırılarak, farmakolojik şaperon etkisi gözlemlenmiştir. Ayrıca farmakolojik şaperon uygulama sonrası mutant ve yabanıl tip AVPR2'lerin hücre içerisindeki yerleşimlerini tespit etmek amacıyla Endoplazmik Retikulum (ER)-izleyici ve Golgi aygıtı-izleyici boyama yöntemi sonrası floresans mikroskobunda görüntüleme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Yapılan tüm deneysel çalışmalar sonucu, OPC41061, OPC31260 ve OPC21268 farmakolojik şaperonlarının, R68W, R67_G69/G107W (Compound hemizigot) ve T273M mutant AVPR2 proteinlerin üzerinde başarılı olduğu tespit edilmiştir. Mutant proteinlerin, kontrol grubu mutant proteinlerine oranla hücre yüzeyine ulaşmalarında ve toplam hücre içi miktarlarında artış gözlemlenmiştir. Anahtar kelimeler: Farmakolojik Şaperonlar, Kalite Kontrol Sistemleri, Nefrojenik Diabetes Insipidus, AVPR2 mutasyonları