Karbon fiber esaslı DNA biyosensör tasarımı

Biyosensörler, biyolojik yanıtları elektriksel sinyallere çeviren analitik cihazlardır. Biyosensör sistemini oluşturan bileşenlerden en önemlisi, tayin edilecek maddeye karşı son derece seçimli bir şekilde etkileşime giren, biyomolekül (algılama) kısmıdır. Bu kısım sayesinde biyosensör, kendine özgün hedef analiti tanıyarak etkileşime girer. Enzimler, mikroorganizmalar, organeller, doku kesitleri, antikorlar ve nükleik asitler sensörlerde biyomolekül olarak kullanılırlar. Algılama yüzeyi olarak DNA'nın kullanıldığı biyosensörlere DNA biyosensörleri adı verilir. DNA biyosensörleri, bir çevirim sistemi ile DNA'dan oluşur. DNA tanıma yüzeyleri, dizisi belli hibridizasyon olaylarının izlenmesinde veya bu yüzeyle etkileşen maddelerin etkileşim durumunun aydınlatılması ile maddenin tespiti ve miktar tayini amaçlı çalışmalarda kullanılabilir. Bazı maddeler, DNA çift sarmal yapısının küçük ve büyük oluklarına bağlanarak ya da doğal yapılı DNA'nın baz çiftleri arasına birikerek etkileşebilir. Bunun sonucunda da DNA'da bulunan elektroaktif bazların sinyallerinde düşüşe veya yükselişe neden olabilirler. Bu sonuca göre de maddenin DNA ile etkileşimi hakkında yorum yapılabilir. Klasik yöntemlerle karşılaştırıldığında, DNA biyosensörlerinin yüksek hassasiyetli, küçültülebilir olmaları, taşınabilir ve tek kullanımlık modellerinin tasarlanabilmesi, ucuz olmaları, düşük miktarda güç ve ürün gereksinimleri olması gibi avantajlarının olması nedeniyle günümüzde DNA biyosensörlerinin kullanımı oldukça artmıştır. DNA biyosensorleri, kalıtsal ve bulaşıcı hastalıkların tanısında, çevre sağlığını tehdit eden çeşitli mikroorganizmaların izlenmesinde, biyolojik ve kimyasal silahların tayininde olmak üzere başlıca üç temel alanda kullanılmaktadır. Günümüzde kalıtsal hastalığa neden olan mutasyonların pek çoğu artık tespit edilebilmektedir. Kan, serum, doku, hücre vb. gibi biyolojik materyallerden belirli bir hastalık, mutasyon gibi kalıtsal bir davranışı simgeleyen özgün DNA dizilerinin saptanma çalışmaları, son yıllarda tıp ve diğer bilimlerde önem kazanmış ve bu çalışmalar bakteri, virüs, parazit ve mantar kökenli hastalıklar ve pek çok kalıtsal hastalıklara neden olan mutasyonların saptanmasında kullanılmaya başlanmıştır. Nükleik asit tanıma yöntemlerine dayanan elektrokimyasal DNA biyosensörleri, kalıtsal ve infeksiyon hastalıkların tanısında bilinen rutin analiz yöntemlerine göre alternatif olarak daha hızlı, ucuz ve kolay bir yöntemdir. Çevre sağlığını tehdit eden özellikle doğal su kaynaklarında vs çeşitli bulaşıcı hastalıklara yol açan mikroorganizmaların tanınması için geliştirilen biyosensörlerinin tasarımı nükleik asit hibridizasyonuna dayalıdır. Elektrokimyasal DNA ciplerinin bir ön tasarımı elektrokimyasal DNA hibridizasyon biyosensörlerinde mevcut olan elektrokimyasal ileticiler, DNA hibridizasyonunu, doğrudan veya DNA interkalatörleri yardımıyla analitik sinyale dönüştürür. Mikroorganizmaya özgün bir DNA dizisinin, ona karşılık gelen hedef diziyle bilinmeyen bir DNA örneği içersinde oluşturduğu baz çiftinin biyokimyasal yapısı bu olayı mümkün kılmaktadır. Fiziksel sinyal çeviricilerin yüksek duyarlılığı ve DNA hibridizasyonunun yüksek seçiciliği, elektrokimyasal biyosensörleri çevre analizlerinin vazgeçilmez bir parçası kılmaktadır. DNA'nın bazı kimyasal maddelerle ve tepkimelerle (ilaç, çevresel atıklar, radyasyon vs.) etkileşmesi ve geliştirilen yeni yöntemlerle bunun incelenmesi; yeni ilaç tasarımı, çevresel atık analizleri, çeşitli kimyasal ve biyolojik silahların tayinine yönelik yeni yöntem geliştirme açısından önemlidir. Son yıllarda eşitli ülkelerin biyolojik silah amaçlı kullandığı, genetik olarak modifikasyona uğramış mikroorganizmalar, elektrot yüzeyine tutturulan ve o mikroorganizmayı temsil eden prob dizi ile hibridizasyonu sonucu, modifiye edilmiş ve doğal olarak bulunan mikroorganizmaya ait sinyal farklılaşmasından yola çıkılarak tespit edilebilir. Literatürde, DNA biyosensörlerinde, DNA tutturma yüzeyi olarak farklı türden elektrotlar ile (altın elektrot, civa elektrot, camsı karbon karbon pastası vs.) yapılmış pek çok çalışma olduğu görülmektedir. Diğer elektrotlardan üstün özellikleri nedeniyle nanoteknolojide geniş bir kullanım alanına sahip olan karbon fiber mikro elektrotların DNA biyosensörlerinde henüz yeterince kullanılmadığı tespit edilmiştir. Bu tez, karbon fiber mikroelektrot esaslı DNA biyosensör tasarımı üzerine odaklanmaktadır. Başlangıçta, DNA hibridizasyonu için elektrokimyasal tespit yöntemleri araştırılmıştır. Çalışmada, hibridizasyon indikatörü olarak metilen mavisi tercih edilmiştir. İlk olarak, kimyasal olarak modifiye edilmiş bir karbon fiber mikro elektrot (CFME) yüzeyine 15-bazlı tek sarmal deoksiribonükleik asit (ssDNA) tutuklanarak yakalama probu elde edilmesi ve yakalama probunun hedef DNA ile hibritleşerek tanıması esasına dayalı bir elektrokimyasal DNA biyosensorü geliştirilmiştir. 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) ve N-hidrosulfosuccinimide (NHS) ile modifiye edilmiş CFME üzerine amin etiketli ssDNA kovalent olarak bağlanmıştır. Yakalama prob elektrodu üzerindeki hibridizayon reaksiyonunun izlenmesi için kare dalga voltametri (SWV) kullanılmıştır. Metilen mavisini (MB) bir hibridizasyon indikatörü gibi kullanarak CFME yüzeyi üzerine çift sarmal DNA oluşturmak için yakalama probu ile hedef DNA dizisi seçici bir şekilde hibritleştirilebilir. Yakalama probu ile hedef DNAnın hibridizasyonu elektroaktif bir indikatör olan metilen mavisinin pik akımında azalma şeklinde gözlenmiştir. Metilen mavisinin pik akımı düşükten yükseğe doğru şu sırayla bulunmuştur: tam eşlenik hedef dizi hibriti ile düzenlenmiş CFME, tek baz eksik hibrit ile düzenlenmiş CFME, tam eşlenik olmayan diziyle düzenlenmiş CFME. Geliştirilen biyosensörün iyi bir kalibrasyon aralığı (0,5 - 10 ppm) ile tayin sınırına (0,72 ppm) sahip olduğu görülmüştür. İkinci olarak, yapılan çalışma CFME üzerine tutuklanan DNA ile metilen mavisi arasındaki etkileşimler üzerine sistematik ve ayrıntılı bir inceleme yapılmıştır. Bu çalışmada, tasarlanan CFME esaslı DNA biyosensörü daha özel ve seçici sonuçlar elde edebilmek için üç farklı hibridizasyon mekanizması dikkate alınarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçların tutarlılığı, çeşitli prob konfigürasyonları (etiketlenmemiş ve amino-etiketli) ile test edilmiştir. Tek sarmal DNA ve çift sarmal DNA ile düzenlenmiş CFME üzerinde biriken MB sinyalleri kare dalga voltametrisi ile ölçülmüştür. CFME üzerindeki DNA'ya bağlı MB için elektrokimyasal parametreler tanımlanmıştır. Bu çalışma, hibridizasyon öncesi yada sonrası MB birikiminin prob konfigürasyonu ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Üçüncü olarak, bu araştırmada CFME esaslı DNA biyosensörü kullanılarak metilen mavisi ile DNA arasındaki etkileşimlere prob seyreltme ajanı etkisi incelenmiştir. Bu çalışmada tasarlanan CFME esaslı DNA biyosensörleri başarıyla oluşturulurken önerilen hibridizasyon mekanizması tiplerine karşılık prob seyreltme ajanı (3-merkaptopropiyonik asit vs.) etkisi göz önünde tutulmuştur. Sonuçlar prob seyreltme ajanının DNA hibridizasyon mekanizmalarının türünü belirlemek için önemli bir faktör olduğunu göstermektedir. Çalışmada, karbon fiber mikroelektrotların DNA biyosensörleri için etkili bir elektrot olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. Geliştirilen sensörün performans özellikleri açıklanmıştır. Elde edilen sonuçlar karbon fiber tabanlı özgün bir elektrokimyasal DNA sensörü geliştirmek için çok yararlı bilgiler sağlamaktadır. Bu çalışmada tasarlanmış CFME esaslı DNA biyosensörü özgün DNA dizilerinin tespitinde başarılı bir şekilde kullanılmıştır.