Cry1Ac ve bar genlerinin agrobacterium tumefaciens aracılığıyla yem bezelyesine (pisum arvense l.) aktarılması

Bu çalışmada, yem bezelyesinde Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla genetik transformasyon protokolünün geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, adventif sürgün rejenerasyonu, gen aktarımının optimizasyonu ve böceklere karşı dirençli transgenik aday bitkilerin PCR ile gen doğrulanmasına yönelik deneysel çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında, yem bezelyesinin Ateş genotipine ait kotiledon ve kök boğum eksplantlarının adventif sürgün rejenerasyon kapasiteleri, çeşitli oranlarda bitki büyüme düzenleyicileri içeren Murashige ve Skoog (MS) besin ortamlarında değerlendirilmiştir. Çalışmada, 6-Benzil Amino Pürin (BAP) ve Naftalin Asetik Asit (NAA) hormonlarıyla desteklenmiş altı farklı kombinasyon kullanılmıştır. Uygulanan hormon konsantrasyonları sırasıyla şu şekildedir: ( 1.00, 2.00, 3.00, 4.00, 5.00 ve 6.00 ) mg l⁻¹ BAP + 0.2 mg l⁻¹ NAA. Elde edilen rejenerasyon sonuçlarına göre hem kotiledon boğum hem de kök boğum eksplantları için en iyi doğrudan sürgün rejenerasyonu için 3 mg l⁻¹ BAP + 0.2 mg l⁻¹ NAA içeren ortam tespit edilmiştir. Çalışmada rejenerasyonu başarıyla tamamlayan sürgünlerin köklenmesini sağlamak amacıyla, 1.00 mg l⁻¹ İndol Asetik Asit (IAA) içeren besin ortamı kullanılmış ve bu ortamda kök oluşumunun etkili bir şekilde gerçekleştiği belirlenmiştir. Bakteri ile muamele görmüş eksplantların seçiminde kullanılan herbisitlerin dozlarının belirlenmesi amacıyla çalışmada 4 farklı konsantrasyonda 2.00, 4.00, 6.00 ve 8.00 mg l-1 fosfinotrisin içeren MS ortamı kullanılmıştır. Sonuç olarak; 2.00 mg l⁻¹ PPT dozu, seleksiyon ortamında başarılı transformantların seçilmesini mümkün kılmıştır. Genetik transformasyonun optimizasyonu için, 35S-cry1Ac-NosT gen kaseti ile birlikte A. transformasyon vektörlerine klonlanmış seçiçi işaret geni olarak npt-II geni ve Bar geni için LBA PGG Bar kaseti kullanılmıştır. Transformasyon çalışmaları sonucunda, toplam 175 adet Cry1Ac ve Bar genlerini taşıyan transgenik aday bitki elde edilmiştir. Aday bitkilerde yapılan PCR sonuçlarına göre Cry1Ac ve Bar genlerinde sırasıyla % 36.66 ve % 17.65 oranlar tespit edilmiştir. Bu çalışma, yem bezelyesi ve benzer bitkilerde zararlı böceklere karşı direnç geliştirme açısından etkili bir genetik transformasyon sistemi kurulabileceğini ortaya koymaktadır.