Erken ovarian yetmezlik (EOY) modeli oluşturulmuş ratlarda bilateral intraovarian plateletten zengin plazma (PRP) enjeksiyonu ile enjeksiyon sırasında verilan ovarian mekanik hasarın fonksiyonel over rezervi üzerindeki rollerinin karşılaştırılması

AMAÇ: Erken ovarian yetmezlik (EOY); 40 yaşın altında izlenen amenore, hipergonadotropizm - hipoöstrojenizm ile beraber giden ovarian fonksiyonların ve rezidüel foliküllerin kaybı ile karakterize bir jinekolojik patolojidir. Pek çok sağlık problemlerine neden olan erken ovarian yetmezlikte ovarian rezervi artırmada çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Doku yenilenmesi, yara iyileşmesi ve deri rejenerasyonu gibi etkilerinin olduğu bilinen plateletten zengin plazmanın (PRP) intraovarian enjeksiyonunun da ovarian rezervi artırdığı iddia edilen yöntemlerden biridir. Öte yandan over rezervini artırdığı iddia edilen yöntemlerden bir diğeri de over dokusunda iyatrojenik olarak gerçekleştirilen mekanik hasardır. Bu yöntemde sonucun primordial foliküllerin mekanik sinyaller ve bu sinyallerin yol açtığı biyokimyasal faktörler aracılığı ile olduğu iddia edilmektedir. Folikül gelişimin iki ana düzenleyici hormonları olan folikül stimüle edici hormon (FSH) ve anti-müllerian hormon (AMH) klinikte ovarian folikül hakkında biyobelirteç olarak kullanılmaktadır. Bu iki hormon seviyeleri düzensiz olduğunda istenmeyen üreme bozukları ile sonuçlanmaktadır. Bu çalışmada ratlarda oluşturulan EOY modeli ile; bir gruba ovarian rezervi artırdığı iddia edilen intraovarian PRP enjeksiyonunun ve bu enjeksiyonun yapılış sırasında overe verilen mekanik hasar ile diğer gruba da iyatrojenik olarak yapılacak olan PRP enjeksiyonu için kullanılan enjektör aracılığıyla yapılan ovarian mekanik hasarın; fonksiyonel ovarian rezervi artırma oranlarının, ratların kanlarında enzime bağlı immünosorban yöntem (Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay) (ELISA) ile ölçülen FSH ve AMH seviyelerinin ve histolojik inceleme ile oosit, folikül sayılarının ve over dokusundaki fibrozis derecelendirilmesinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. YÖNTEM: Çalışmamız Dokuz Eylül Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarında Temmuz 2023- Ekim 2023 tarihleri arasında gerçekleştirilmiştir. Dokuz Eylül Üniversitesi Multidisiplin Laboratuvarı Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu onayı alınmıştır. Çalışmamıza, Whistar Albino cinsi 180-220 g (8-10 haftalık) dişi ratlar dahil edilmiştir. Denekler rastgele dört gruba ayrılmıştır. A grubu kontrol grubu [1 mL/kg intraperitoneal tek doz %0,9 sodyum klorür (NaCl) içeren serum fizyolojik], B grubu erken ovarian yetmezlik (EOY) grubu, EOY modeli yaratılanlar (150 mg/kg intraperitoneal tek doz siklofosfamid); C grubu EOY+PRP+MOH grubu, EOY modeli yaratılıp intraovarian PRP enjeksiyonu ve enjeksiyon sırasındaki mekanik ovarian hasar (MOH) (550.000 platelet/ 200 μl serum fizyolojik), D grubu EOY+MOH grubu, EOY modeli yaratılıp MOH (15.gün insülin enjektörü ile) oluşturulmuştur. Erken ovarian yetmezlik modeli oluşturulmuş olan ratlarda maksimum etki açısından intraperitoneal siklofosfamid enjeksiyonu sonrası 15 gün beklenmiştir. C grubundaki ratlara PRP enjeksiyonu ve bu esnada gerçekleşen MOH yapıldıktan, D grubundaki ratlara sadece MOH gerçekleştirildikten sekiz hafta sonra; tüm gruplardaki ratlardan FSH ve AMH düzeyleri bakılıp karşılaştırılmıştır. Plateletten zengin plazma oluşturabilmek için 3 adet rattan intrakardiyak olarak enjektör yardımı ile kan alınmıştır. Plateletten zengin plazma elde edilmesinin ardından bilateral intraovarian enjeksiyon yapılacak olan ratlara insülin enjektörü yardımı ile 550.000 platelet/ 200 μl serum fizyolojik dozunda dört kez yapılan penetrasyon ile PRP enjekte edilmiştir. İnsülin enjektörü ile yapılacak olan penetrasyon sayısı ile aynı sayıda penetrasyon, D grubu ratlara uygulanmıştır. Ratların anestezisi eter ile sağlanmıştır. Analjezi için sadece C ve D grubundaki ratlara intraperitoneal parol kullanılmıştır. Deney bittikten sonra serum hormon değeri çalışılması amacı ile intrakardiyak olarak enjektör yardımı ile kan alınmıştır ve hayvanların ölümü gerçekleştirilmiş ve histolojik inceleme yapılmıştır. Doku kesitleri histokimyasal ve immunohistokimyasal boyama yapılarak Olympus BX 51 ışık mikroskobu ile değerlendirilmiştir. Over dokusunda oluşan fibrozisin derecelendirilmesi, Masson's Trichrome boyası ile yapılmıştır. İmmunohistokimyasal incelemeler için Avidinbiyotin-peroksidaz yöntemi (ABC metodu) ile uygulanmıştır. BULGULAR: Toplam 20 adet Whistar albino cinsi rata ait sonuçlar incelendi. Serum FSH değeri sadece SF grubu ile EOY grubu arasında anlamlı olarak farklı görülmüştür; SF grubu ile EOY+PRP+MOH, EOY+MOH grubu arasında anlamlı fark görülmemiştir. Yine EOY+PRP+MOH ile EOY+MOH grubu arasında da anlamlı fark saptanmamıştır. Son olarak serum FSH/AMH düzeyi oranları hiçbir grup arasında anlamlı farklılık göstermemiştir. Hematoksilen&Eozin ile boyama yapılan preparatların incelenmesinde primordial folikül sayıları ve sekonder folikül sayıları gruplar arasında anlamlı fark göstermemektedir. Primer folikül sayısı, EOY grubu ve EOY+MOH grubu arasında anlamlı olarak farklı hesaplanmışken, diğer gruplar arasında anlamlı fark göstermemektedir. Graaf folikül sayısı, SF grubu ve EOY+PRP+MOH grubu arasında anlamlı olarak farklı hesaplanmışken, diğer gruplar arasında anlamlı fark göstermemektedir. Atretik folikül sayıları; SF grubu ve EOY grubu, SF grubu ve EOY+PRP+MOH grubu, SF grubu ve EOY+MOH grubu, EOY grubu ve EOY+PRP+MOH grubu, EOY grubu ve EOY+MOH grubu arasında anlamlı olarak farklı hesaplanmışken EOY+PRP+MOH grubu ve EOY+MOH grubu arasında anlamlı fark hesaplanmamıştır. EOY grubuna ait over kesitlerinde SF grubuna kıyasla normal histolojik görüntünün kaybı gözlendi. EOY+PRP+MOH grubuna ait kesitler incelendiğinde; EOY grubuna kıyasla primordial ve primer folikül sayısında artış olduğu gözlendi. EOY grubu ile kıyaslandığında normal görünen farklı sayı ve boyuttaki folikül sayılarında artış olsa da SF grubuna kıyasla normal histolojik görüntünün tam olarak korunmadığı; korpus luteum ve atretik foliküller görünümde SF grubuna kıyasla artış olduğu gözlendi. Atretik folikül sayısında EOY grubuna kıyasla azalma gözlendi. EOY+MOH grubunun over kesitlerinde, EOY+PRP+MOH grubuna benzer şekilde sağlıklı ve farklı aşamalardaki foliküllerin artışı gözlendi. Atretik folikül sayısında EOY grubuna oranla azalma olduğu gözlendi. Gruplara göre Masson Trikrom boyamanın H skor dağılımına bakıldığında; EOY grubundaki fibrozis varlığının EOY+PRP+MOH ve SF gruplarına kıyasla istatistiksel olarak anlamlı olduğu görüldü (p=0,04; p=0,00). SF grubuna kıyasla EOY+MOH grubundaki kollajen artışı belirgin (p=0,06) ve EOY grubuna kıyasla EOY+MOH grubundaki fibrozis azalmış olsa da bu farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı görüldü (p=1). SF grubunda Kaspaz-3 immün reaktivitesi incelendi. Granüloza hücrelerinde ve daha belirgin olarak teka internada, Kaspaz 3 pozitifliği bazal düzeyde gözlendi. Gelişimin farklı aşamalarında olan foliküllerde yer alan primer oositlerde de yer yer Kaspaz-3 için zayıf bir immün pozitiflik gözlendi. Korpus luteum hücrelerinde ise granüloza hücrelerine göre daha kuvvetli bir boyanma görüldü. EOY grubu over kesitlerinde Kaspaz-3 immün reaktivitesi incelendiğinde pozitif hücre sayısının tüm alanlarda arttığı; farklı gelişim aşamalardaki foliküllerin granüloza hücrelerinde ve teka internada, oositlerde ve korpus luteumda immün pozitifliğin belirgin olduğu görüldü. Ancak istatistiksel olarak bu artış anlamlı değildi (p=0,15). EOY+PRP+MOH grubuna ait over kesitlerinde Kaspaz-3 immün reaktivitesi incelendiğinde, granüloza ve korpus luteum hücrelerinde ve oositte EOY grubuna göre daha zayıf bir boyanma gözlendi ve immün pozitiflikteki bu azalma istatistiksel olarak anlamlıydı (p=0,00). SF grubuyla kıyaslandığında ise immün pozitif hücre sayısı foliküllerde benzer şekildeyken, diğer alanlarda daha az belirgindi ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı değildi (p=1). EOY+MOH grubunda ise EOY grubu ile kıyaslandığında immün pozitif hücre sayısının azaldığı, SF ve EOY+PRP+MOH grupları ile kıyaslandığında ise immün pozitifliğin arttığı görüldü. Ancak bu değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı değildi (p=0,44; p=1; p=0,57). SF grubunda Ki-67 immün reaktivitesi incelendi. Granüloza hücrelerinde daha belirgin olmakla birlikte korteksteki diğer hücrelerde de immün pozitiflik gözlendi. Korpus luteum hücrelerinde ise granüloza hücrelerine göre daha zayıf bir boyanma görüldü. EOY grubunda immün pozitif hücre sayısının bazı örneklerde azaldığı, bazı örneklerde ise SF grubu ile benzer olduğu görüldü. Yine farklı gelişim aşamalardaki foliküllerin granüloza hücrelerinde immün pozitiflik diğer hücrelere kıyasla daha belirgindi. Ancak istatistiksel olarak bu azalma anlamlı değildi (p=1). EOY+PRP+MOH grubundaki tüm kortikal alandaki hücrelerde SF ve EOY grubuna göre daha kuvvetli bir boyanma gözlendi ve immün pozitiflikteki bu artış her iki gruba göre de istatistiksel olarak anlamlıydı (p=0,02; p=0,02). EOY+MOH grubunda EOY grubu ile kıyaslandığında immünpozitif hücre sayısında artış eğilimi olsa da immünhistokimyasal bulguları benzerdi ve iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark yoktu (p=1). EOY+MOH grubu ve EOY+PRP+MOH grubu ile kıyaslandığında immünpozitif hücre sayısı belirgin olarak azalmış olsa da bu azalma istatistiksel olarak anlamlı değildi (p=0,17). TARTIŞMA: İntraovarian PRP veriliş sırasındaki mekanik ovarian hasarın izole etkisi için ratlar kıyaslandığında EOY+PRP+MOH grubuna göre EOY+MOH grubunda; primordial sayısında azalma, primer folikül sayısında artma, sekonder folikül sayısında azalma, graaf folikül sayısında artma, atretik folikül sayısında azalma izlenmiş olsa da bu farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (tüm sonuçlarda p=1). Serum FSH ve AMH düzeyi artmıştır ancak istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p=0,99, p=1). Masson trikrom ile yapılan fibrozis skorlamasında H skoru artmıştır ancak istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p=0,58). İmmunohistokimyasal olarak Ki-67 ile yapılan boyamada proliferasyonun daha az olduğu görülmüştür ancak istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p=0,17). İmmunohistokimyasal olarak Kaspaz-3 ile yapılan boyamada apoptozun daha fazla olduğu görülmüştür ancak istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p=0,57).